hTERT,siRNA抑制胆囊癌细胞端粒酶活性及增殖运动的研究

　 作者：丁昂　童赛雄　冯平　秦新裕    作者单位：1.复旦大学附属中山医院，上海 200032；2.徐州医学院附属淮安第四人民医院，江苏 淮安 223300

　 【摘要】  ［目的］ 探讨hTERT,siRNA对GBC,SD端粒酶活性、琥珀酸脱氢酶（SDH）活性、侵袭、hTERT mRNA、hTERT蛋白的作用及其相关机制。［方法］在质粒pGCsi,H1/GFP,hTERT干扰后，采用端粒酶TRAP、半定量RT,PCR和Western blot方法检测GBC,SD端粒酶活性、hTERT基因和β,catenin基因mRNA、蛋白质表达水平。四甲基偶氮唑盐（MTT）光吸收法检测SDH活性，运用Transwell小室了解癌细胞侵袭情况。［结果］ pGCsi,H1/GFP,hTERT对GBC,SD端粒酶活性、SDH活性、侵袭、hTERT mRNA、hTERT蛋白均有抑制作用并随浓度升高而增强。pGCsi,H1/negative对上述指标无明显抑制作用，与pGCsi,H1/GFP,hTERT抑制作用比较差异有统计学意义（P<0.01）。［结论］ pGCsi,H1/GFP,hTERT通过降低hTERT mRNA及蛋白表达降低，进而抑制端粒酶、SDH活性及其侵袭力。

　 【关键词】  胆囊肿瘤　RNA干扰　基因　蛋白质　hTERT　β,catenin

　 Inhibitory Effect of hTERT,siRNA on Telomerase Activity Cell Proliferation and Migration in Gallbladder Cancer Cells

    DING Ang1, TONG Sai,xiong1, FENG Ping2, et al.

    （1.Zhongshan Hospital of Fudan University, Shanghai 200032, China;

    2.Huaian Forth Hospital of Suzhou Medical College, Huaian 223300, China）Abstract： ［Purpose］ To explore the of hTERT,siRNA effect on GBC,SD cell telomerase activity，SDH activity， invasion efficiency, hTERT mRNA and hTERT protein and their mechanisms. ［Methods］ Telomerase activity，mRNA and protein of hTERT and β,catenin in GBC,SD were detected by telomerase TRAP，RT,PCR and Western blot techniques，respectively; SDH activity, by MTT; and invasion assay by Transwell chamber after GBC,SD cells were interfered in pGCsi,H1/GFP,hTERT vector. ［Results］ pGCsi,H1/GFP,hTERT could inhibit GBC,SD cell telomerase activity，SDH activity，and invasion efficiency，expression of hTERT mRNA and protein. The inhibition effect was correlated with increase of pGCsi,H1/GFP,hTERT vector concentrations. pGCsi,H1/negative vector had no inhibition on above indexes. A statistically significant difference existed between pGCsi,H1/GFP,hTERT vector and pGCsi,H1/negative vector (P<0.01). ［Conclusion］ pGCsi,H1/GFP,hTERT can inhibit telomerase activity，SDH activity and invasion by down regulating the expression of mRNA and protein of hTERT.

    Key words: gallbladder neoplasms; RNA interference; gene; protein; hTERT; β,catenin

    β,catenin与胆囊的恶性病变密切相关，端粒酶、hTERT、β,catenin在人胆囊癌细胞系呈阳性表达，其中，hTERT在胆囊癌中阳性表达率为84.1%，它们可提示胆囊癌细胞的生物学特性，影响胆囊癌细胞的增殖、运动和侵袭力[2，3]，因此，以hTERT为靶点，对胆囊癌细胞的体外干预研究将有助于为胆囊癌的治疗提供一条新途径。本研究将应用hTERT RNAi技术对GBC,SD细胞代谢、生长、侵袭和端粒酶活性进行观察，同时了解其对hTERT和β,catenin的作用，并探讨其相关机制。

    1 材料与方法

    1.1 材 料

    胆囊癌细胞株GBC,SD购自中国科学院上海分院细胞生物研究所，DH5α由复旦大学上海医学院生化教研室提供，pGCsi,H1/GFP,hTERT（h1）和pGCsi,H1/negative（h2）质粒购自上海吉凯基因公司，其中h1质粒含有hTERT mRNA特异片段，GenBank编号NM_003219，1745bp~1764bp，而h2质粒含有的是随机片段。

    1.2 方 法

    1.2.1 质粒制备

    按照上海生工SK1192、SK1244质粒抽提试剂盒的方法筛选制备质粒，经上海博亚公司测序，鉴定正确后用于基因转染。

    1.2.2 胆囊癌细胞株的培养

    用含10％胎牛血清DMEM，在37℃、5％CO2培养箱中培养。

    1.2.3 质粒转染

    采用阳离子脂质体转染法。将5×104个细胞转接于六孔板内，培养48h。将质粒—脂质体复合物转染至细胞中（质粒：脂质体=1：5），37℃、5%CO2条件下在无血清、无抗生素的培养液中培养6h后加新鲜10％FCS的培养液至3ml/孔，2d后用于实验。

    1.2.4 端粒酶活性检测

    按照端粒酶华美公司TRAP,Hyb 试剂盒的方法测定端粒酶活性（OD值）。

    1.2.5 RT,PCR

    用上海生工UNIQ,10柱总RNA抽提试剂盒提取总RNA，RNA定量采用紫外分光光度仪，取1μg的RNA，加逆转录酶MMLV（Gibco）200U，按随机六聚脱氧核苷酸引物合成法合成cDNA。 hTERT和β,catenin基因扩增的引物及内对照β,actin引物均由上海生工合成，其序列如下：

    hTERT上游引物：5＇,CGGAAGAGTGTCTGGAGCA,3＇

    hTERT下游引物：5＇,CGACGTAGTCCATGTTCAC,3＇

    β,catenin上游引物：5＇,AAAGCGGCTGTTAGTCACTGG,3＇

    β,catenin下游引物：5＇,GACTTGGGAGGTATCCACATCC,3＇

    β,actin上游引物：5＇,CATCTTCCAGGAGCGAGATC,3＇

    β,actin下游引物：5＇,GGGATGATGTTCTGGAGAG,3＇

    1.2.6 Western印迹分析

    常规离心癌细胞，用RIPA缓冲液重悬细胞团块，冰浴条件下分别加蛋白酶抑制剂PMSF（终浓度为100μg/ml）、亮抑蛋白酶肽（终浓度为10μg/ml）、Aprotinin（终浓度10μg/ml），冰浴作用30min。然后12 000r/mim 4℃离心10min，分离细胞裂解液上清，用Bio,Rad公司蛋白质定量试剂确定各蛋白质浓度。在固定蛋白质浓度条件下，进行100～120g/LSDS,PAGE，然后转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。印迹膜分别用一抗（1:1000稀释）作用；再用HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗（1:2000稀释）作用。蛋白质信号检测根据ECL,Western印迹检测试剂盒说明进行，用Alphalmager 2000 软件分析。

    1.2.7 琥珀酸脱氢酶（SDH）活性

    （1）细胞培养及基因转染同前。（2）于37℃、5%CO2培养箱中培养6h后收集细胞。（3）消化培养细胞、计数。96孔板分别加入200μl细胞悬液，按5×103/孔接种，每个浓度重复3次，培养48h后，换DMEM维持液（1％FBS）及MTT，MTT终浓度为0.5mg/ml，37℃、5％CO2条件下培养4h，弃上清，加DMSO 100μl/孔，吹打反应4～5min，置酶标仪570nm处测OD值。

    1.2.8 细胞增殖计数

    （1）取指数增殖期细胞5×104接种于6孔板中，培养48h，基因转染同前。每个浓度重复3次。（2）于37℃、5％CO2条件下培养48h后收集细胞，计算活细胞数，取平均值。

    1.2.9 体外运动迁移实验[4]

    60mm培养皿内接种1×105个肿瘤细胞，37℃、5％CO2条件下培养至细胞覆盖率为95％左右，用灭菌双面剃须刀片在培养皿中刮制三条整齐而平行的45mm×5mm的无细胞区，冲洗后加入质粒，具体质粒转染同前，于CO2培养箱中培养6h后加无抗生素含10％胎牛血清的培养液至3ml/孔，培养24h后弃培养液，中性甲醛固定10min，姬姆萨染色，刮痕整齐侧取3个视野，共9个视野，比较不同组之间迁移细胞数。

    1.2.10 体外侵袭实验[4]

    （1）细胞培养及基因转染同前，24h后收集细胞。（2）Transwell微孔滤膜外部底侧涂10μl Collagen type Ⅰ，用0.5mg/ml Matrigel 10μl铺于滤膜上，下室加入600μl培养液，将1×105个/ml的肿瘤细胞悬液以100μl加入上室。37℃、5％CO2孵育24h，孵育结束后稍稍水洗，用棉签擦去滤膜表面未穿膜的肿瘤细胞。滤膜中性甲醛固定30min，姬姆萨染色，切下膜固封于载玻片上。200倍光镜下计数膜背面侵袭的细胞数，计数中间和四周5个视野，计算平均值，每组3次重复。

    1.3 统计学方法

    采用SPSS13.0软件对上述结果进行分析，统计数据以均数±标准差来显示，同组间比较采用单因素方差分析。

    2 结 果

    经上海博亚公司测序，h1经测序其所含基因序列和所设计序列一致（GenBank编号是NM_003219，1745bp~1764bp）。荧光显微镜、400倍下观察发现GBC,SD细胞转染h1、h2质粒后出现荧光。表明用脂质体法将基因转染GBC,SD细胞可行。

    2.1 端粒酶活性检测

    干扰48h后检测端粒酶活性（表1）。h1质粒在0.25μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml浓度下，对端粒酶的抑制率分别是5.51％、39.34％、64.34％、79.41％；对照组的抑制率是5.14％。

    2.2 半定量PCR结果

    2d后，RT,PCR检测各组hTERT mRNA表达，在4、5、6道siRNA干扰后，hTERT的表达较未干扰组有明显减少（P<0.01），但h2组siRNA和3道siRNA组较正常对照组无明显变化（P>0.05）。随着质粒浓度的增加，3、4、5、6道siRNA干扰后，hTERT表达逐渐减少，相互间的差异有显著性（P<0.01）（图1）。在同样条件下，2～6道β,catenin的表达较未干扰组无明显减少（P>0.05）（图2）。

    2.3 Western blot印迹

    干扰48h后提取蛋白，Western blot检测各组hTERT蛋白表达（图3）。4、5、6道siRNA干扰后，hTERT蛋白表达较未干扰组有明显减少（P<0.01），但h2组siRNA和3道siRNA组较正常对照组无明显变化（P>0.05）。随着质粒浓度的增加，3、4、5、6道siRNA干扰后，hTERT蛋白表达逐渐降低，相互间的差异有显著性（P<0.01）。6号siRNA组hTERT蛋白表达较正常对照组减少了76.60%，效果最为显著。但是，2～6组β,catenin蛋白表达较未干扰组无明显减少（P>0.05）。

    2.4 SDH活性

    干扰48h后检测SDH活性（表1）。h1质粒在上述浓度下，对SDH的抑制率分别是6.10％、34.39％、53.17％、78.54％；对照组的抑制率是5.12％。

    2.5 细胞增殖计数

    干扰48h后检测细胞增殖数（表1）。h1质粒在相同浓度下，对细胞增长的抑制率分别是4.64％、39.66％、61.94％、75.66％；对照组的抑制率3.84％。

    2.6 体外运动迁移实验

    干扰24h后检测细胞运动迁移数（表1）。h1质粒在相同浓度下，对细胞运动迁移的抑制率分别是10.94％、29.69％、52.34％、78.91％；对照组的抑制率是9.37％（图4，图5）。

    2.7 体外侵袭实验

    干扰24h后检测穿膜细胞数（表1）。h1质粒在相同浓度下，对细胞侵袭抑制率分别是14.71％、30.55％、49.47％、81.82％；对照组的抑制率是10.70％（图6，图7）。

    3 讨 论

    胆囊癌是胆道系统最常见的恶性肿瘤，与端粒酶异常表达密切相关，其中hTERT基因是合成端粒酶全酶的限速因素，和β,catenin均与胆囊癌细胞的生物学特性密切相关[2，3]。

    RNAi已成为分子生物学研究的主要技术手段之一。目前，利用RNAi对白血病[5]、艾滋病[6]、乙型肝炎[7]、丙型肝炎[8]的治疗研究已取得一定进展，成功地下调了相关基因的表达，其作用机制是通过活化的小干扰RNA ( small interference RNA，siRNA ) 靶向降解目的mRNA，从而使目的基因表达沉默。本实验所用真核细胞表达质粒h1含hTERT,siRNA干扰基因序列，可保证与靶基因同源、序列特异双链RNA(dsRNA)合成。质粒扩增后，经测序其所含基因序列和要求一致，可以用于基因转染，h1、h2均含有GPF片段，荧光显微镜400倍下观察发现GBC,SD细胞转染质粒后出现荧光。用半定量PCR和Western blot检测干扰48h后对照组（质粒浓度2μg/ml）、实验组hTERT mRNA和hTERT蛋白表达时发现，h1浓度在0.5μg/ml时，hTERT mRNA和hTERT蛋白表达明显受到抑制，与未转染组、对照组比较有显著性差异，而且随浓度增高，抑制愈明显；但是当h1浓度在0.25μg/ml时，与未转染组和对照组比较差异无统计学意义，说明siRNA的作用呈浓度依赖性。在不同浓度h1质粒作用下，GBC,SD的端粒酶活性也受到不同程度抑制；当h1质粒浓度为2.0μg/ml浓度时，对端粒酶活性、SDH活性以及细胞侵袭抑制率分别是79.41％、78.54％和81.82％，与Zou的研究结果基本一致[9]，说明hTERT是端粒酶关键的限速因素。在相同的h1质粒浓度下，GBD?鄄SD的代谢和侵袭力均相应受到抑制，说明端粒酶影响着细胞的生长代谢，是肿瘤细胞重要的靶基因。影响hTERT基因表达，就可以降低端粒酶活性，进而可以抑制胆囊癌细胞的生物学特性。

    对照组h2质粒对GBC,SD细胞的端粒酶、SDH活性、侵袭、细胞代谢均无明显作用，表明siRNA对靶基因的特异性且无毒性。h1对β,catenin mRNA和β,catenin蛋白没有明显抑制，说明β,catenin不是hTERT的下游基因。

    端粒酶在生物代谢、衰老、应激和肿瘤发生中起重要作用，利用RNAi靶向hTERT基因很有可能成为治疗肿瘤的重要手段之一[9]。针对靶基因不同位点，设计更特异，效力更高的siRNA，以提高对肿瘤细胞的抑制效果，是基因治疗的一个重要途径，同时为今后进行质粒的稳定转染提供基础。

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[3] 丁昂, 童赛雄, 秦新裕, 等. hTERT和β,catenin在胆囊癌中的表达及其临床意义[J]. 中华实验外科杂志, 2005, 22:1133-1135.

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