雷帕霉素对肝癌肝移植术后复发影响的实验研究

作者：陈颖华， 蔡常洁， 陆敏强， 郭中敏， 陈规划    作者单位：中山大学 附属第三医院肝脏移植中心∥器官移植研究所

【摘要】  【目的】 探讨雷帕霉素对肝癌肝移植术后复发影响。【方法】 应用ＭＴＴ细胞增殖实验观察雷帕霉素对ｗａｌｋｅｒ-２５６肿瘤细胞增殖的影响；应用流式细胞仪观察雷帕霉素对ｗａｌｋｅｒ-２５６肿瘤细胞周期的影响；应用荧光定量ＲＴ-ＰＣＲ观察雷帕霉素ｗａｌｋｅｒ-２５６肿瘤细胞ＶＥＧＦｍＲＮＡ表达的影响。观察雷帕霉素对免疫抑制肝转移癌大鼠模型肿瘤生长情况、肿瘤组织ＰＣＮＡ指数、肿瘤复发率及生存情况的影响。【结果】 ＭＴＴ细胞增殖实验示雷帕霉素对ｗａｌｋｅｒ-２５６肿瘤细胞有抑制作用，ＩＣ５０为９．６０ ｎｇ／ｍＬ；细胞周期检测示雷帕霉素组Ｇ１／Ｇ０期比例为５５．２％ ± ０．１％较对照组（４５．２％±０．４％）高（Ｐ ＜ ０．０５）；雷帕霉素组ＶＥＧＦｍＲＮＡ表达为（４．５０ ± ０．１３）×１０－２较对照组［（７０．８ ± １．３）×１０－２］低（Ｐ ＜ ０．０５）。雷帕霉素组荷瘤大鼠荷瘤肝重为（１２．５ ± ０．２）ｇ，较对照组［（１４．４ ± ０．３）ｇ］轻，两组间差别有统计学意义（Ｐ ＜ ０．０５）；雷帕霉素组荷瘤大鼠荷瘤肝质量比为（６１．３ ± ０．６）×１０－３，较对照组［（７０．８ ± １．３）×１０－３］小，两组间差别有统计学意义（Ｐ ＜ ０．０５）；雷帕霉素组大鼠肿瘤复发率为９０％，对照组为９５％，两组比较差异无统计学意义；雷帕霉素组生存时间为（２６．５ ± ２．５）ｄ，对照组为（１４．８ ± ２．３）ｄ，两组间差别有统计学意义（Ｐ ＜ ０．０５）。雷帕霉素组大鼠ＰＣＮＡ指数为６４．１％ ± ２．１％，较对照组（８０．８％ ± １．０％）低，差别有统计学意义（Ｐ ＜ ０．０５）。【结论】 虽然雷帕霉素对降低免疫抑制下的肿瘤复发率作用不明显，但能明显抑制肿瘤生长速度，延长带瘤生存时间。

【关键词】  雷帕霉素； 肝癌； 肝移植； 复发

　　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ａｆｔｅｒ ＯＬＴｘ　ｆｏｒ ＨＣＣ ｗｉｔｈ Ｒａｐａｍｉｎｅ

　　ＣＨＥＮ Ｙｉｎｇ-ｈｕａ， ＣＡＩ Ｃｈａｎｇ-ｊｉｅ， ＬＵ Ｍｉｎ-ｑｉａｎｇ， ＧＵＯ Ｚｈｏｎｇ-ｍｉｎ， ＣＨＥＮ Ｇｕｉ-ｈｕａ

　　（Ｔｈｅ Ｏｒｇａｎ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ａｎｄ Ｌｉｖｅｒ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ∥Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌｉｖｅｒ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｔｈｅ Ｔｈｉｒｄ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， ＳＵＮ Ｙａｔ-ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６３０， Ｃｈｉｎａ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ＳＵＮＹａｔ-ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１００８０， Ｃｈｉｎａ）

　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： 【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】 Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ａｆｔｅｒ ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ ｌｉｖｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ （ＯＬＴｘ） ｆｏｒ ｈｅｐａｔｏ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ （ＨＣＣ） ｗｉｔｈ Ｒａｐａｍｉｎｅ． 【Ｍｅｔｈｏｄｓ】 ＭＴＴ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｗａｌｋｅｒ-２５６ ｃｅｌｌｓ． Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｗａｌｋｅｒ-２５６ ｃｅｌｌｓ． Ｒｅａｌ-ｔｉｍｅ ＲＴ-ＰＣＲ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ （ＶＥＧＦ） ｍＲＮＡ ｏｆ ｔｈｅ Ｗａｌｋｅｒ-２５６ ｃｅｌｌｓ． Ｔｈｅ ４０ ｗｉｓｔａｒ ｒａｔｓ ｗｅｒｅ ｃｈｏｓｅｎ ａｎｄ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ２ ｇｒｏｕｐｓ： Ｒａｐａｍｉｎｅ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ． Ｔｈｅ ｗａｌｋｅｒ-２５６ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｗａｓ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｖｉａ ｐｏｒｔａｌ ｖｅｎｏｕｓ ｉｎ ｂｏｔｈ ｇｒｏｕｐｓ． ＳＲＬ ｇｒｏｕｐ ｒｅｃｅｉｖｅｄ ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒｅｇｉｍｅ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｒａｐａｍｉｎｅ ［ＭＰ＋ ＣＳＡ＋ Ｒａｐａｍｉｎｅ］． Ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｈｅ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒｅｇｉｍｅ （ＭＰ＋ＣＳＡ）． Ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｃｏｕｒｓｅ ｏｆ ６０ ｄａｙｓ， ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｗｉｔｈ ｔｕｍｏｒ， ｈｅｐａｔｏｗｅｉｇｈｔ-ｗｅｉｇｈｔ ｒａｔｉｏ， ｒｅｃｒｕｄｅｓｃｅｎｃｅ ｒａｔｅ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ （ＰＣＮＡ） ｌａｂｅｌｉｎｇ ｉｎｄｅｘ ｏｆ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｗｅｒｅ ｒｅｃｏｒｄｅｄ． 【Ｒｅｓｕｌｔｓ】 ＭＴＴ ｓｈｏｗｅｄ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｗａｌｋｅｒ-２５６ ｃｅｌｌｓ ｉｎｃｕｂａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｒａｐａｍｉｎｅ ｗａｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ， ａｎｄ ｔｈｅ ＩＣ５０ ｗａｓ ９．６０ ｎｇ／ｍＬ． Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｓｈｏｗｅｄ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｏｆ ｗａｌｋｅｒ-２５６ ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｒａｐａｍｉｎｅ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ａｒｒｅｓｔｅｄ ｉｎ ｓｔａｇｅ ｏｆ Ｇ１／Ｇ０（Ｐ ＜ ０．０５）． Ｒｅａｌ-ｔｉｍｅ ＲＴ-ＰＣＲ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ ｉｎ ｗａｌｋｅｒ-２５６ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｌｏｗｅｒ ｉｎ ｔｈｅ Ｒａｐａｍｉｎ ｇｒｏｕｐ （Ｐ ＜ ０．０５）． Ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｗｉｔｈ ｔｕｍｏｒ： Ｒａｐａｍｉｎｅ ｇｒｏｕｐ （１２．５ ± ０．２）ｇ ｖｓ． ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ （１４．４ ± ０．３）ｇ  （Ｐ ＜ ０．０５）， ｈｅｐａｔｏｗｅｉｇｈｔ-ｗｅｉｇｈｔ ｒａｔｉｏ： Ｒａｐａｍｉｎｅ ｇｒｏｕｐ （６１．３ ± ０．６） × １０－３， ｌｅｓｓ ｔｈａｎ． ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ （７０．８ ± １．３） ×１０－３（Ｐ ＜ ０．０５）． Ｒｅｃｒｕｄｅｓｃｅｎｃｅ ｒａｔｅ ｗａｓ ９０％ （１８／２０） ｉｎ ＳＲＬ ｇｒｏｕｐ，ｖｓ． ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ， ９５％ （１９／２０）， ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ （Ｐ ＞ ０．０５）． Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｔｉｍｅ ｗｅｒｅ （２６．５ ± ２．５）ｄ ｉｎ Ｒａｐａｍｉｎｅ ｇｒｏｕｐ， ｗｈｉｌｅ ｌｏｎｇｅｒ ｔｈａｎ （１４．８ ± ２．３）ｄ ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ （Ｐ ＜ ０．０５）． Ｔｈｅ ＰＣＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｉｎｄｅｘ ｗａｓ ６４．１％ ± ２．１％ ｉｎ Ｒａｐａｍｉｎｅ ｇｒｏｕｐ， ａｎｄ ８０．８％ ± １．０％ ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  （Ｐ ＜ ０．０５）． 【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】 Ｒａｐａｍｉｎｅ ｃａｎｎｏｔ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｒｅｃｒｕｄｅｓｃｅｎｃｅ ｒａｔｅ， ｂｕｔ ｃａｎ ｓｕｐｐｒｅｓｓ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｏｌｏｎｇ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｔｉｍｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎ ｖｉｖｏ．

　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｒａｐａｍｉｎｅ； ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ； ｌｉｖｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ； ｒｅｃｒｕｄｅｓｃｅｎｃｅ

　　术后免疫抑制剂的应用是影响肝癌肝移植术后肿瘤复发的原因之一。雷帕霉素是一种既有免疫抑制作用，同时又具有通过ｍＴＯＲ途径抑制细胞增殖的新型免疫抑制剂［１］。肝癌肝移植术后使用雷帕霉素对肝移植术后肿瘤的复发的影响尚未明确。本实验研究通过观察雷帕霉素对ｗａｌｋｅｒ-２５６肿瘤细胞系的抑制作用及其对大鼠肝癌肝移植术后转移癌的影响，探讨雷帕霉素对肝癌肝移植术后复发影响。

　　１ 材料与方法

　　１．１ 实验材料

　　①实验动物：无特定病原体（ＳＰＦ级）Ｗｉｓｔａｒ成年雄性大鼠４０只，体质量２４０ ～ ２８０  ｇ，中山大学实验动物中心提供（许可证号：粤监证字２００５Ａ０５５）。②细胞株：Ｗａｌｋｅｒ-２５６肿瘤细胞株，购买自武汉大学生物材料和培养物中心。③试剂：环孢素Ａ注射液（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ Ａ，诺华制药公司）；甲泼尼龙琥珀酸钠（Ｓｏｌｕ-Ｍｅｄｒｏｌ，辉瑞公司）； 雷帕霉素（Ｒａｐａｍｉｎｅ， 惠氏制药公司）， ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ公司），胎牛血清（Ｇｉｂｃｏ公司），细胞周期检测试剂盒（ＢＤ公司）， ＭＴＴ（ＡＭＳＲＥＣＯ公司）， ＤＭＳＯ（ＡＭＳＲＥＣＯ公司），ＴＲＩ-ＺＯＬ试剂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ公司）。④仪器：酶标仪（ＢＩＯ- ＲＡＤ 公司 Ｍｏｄｅｌ ６８０），９６孔板离心机（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司），流式细胞仪（ＢＤ公司），荧光定量ＰＣＲ试剂盒（ＴＡＫＡＲＡ公司），逆转录试剂盒（ＫＥＹＧＥＮ公司）。

　　１．２ 体外实验

　　１．２．１ ＭＴＴ比色分析 在９６ 孔板中加入细胞（０．５ × １０４ ～ １ × １０４／孔），加入不同质量浓度的雷帕霉素，于３７ ℃，体积分数为５％的ＣＯ２条件下孵育。７２ ｈ后加入ＭＴＴ（用ＰＢＳ配成浓度５ ｍｇ／ｍＬ），２０ μＬ／孔，继续孵育４ ｈ，使用９６孔板离心机，８００ ｒ／ｍｉｎ（ｒ ＝ ５ ｃｍ），离心５ ｍｉｎ，弃上清，加入ＤＭＳＯ（１５０ μＬ／孔），避光于摇床摇匀１０ ｍｉｎ， ５７０ ｎｍ波长处测吸收光度（Ａ５７０）， 按下式计算细胞活力：细胞活力＝（实验孔Ａ５７０－阴性对照孔Ａ５７０）／（阳性对照孔Ａ５７０－阴性对照孔Ａ５７０） × １００％，并用改进的Ｋｒｂｅｒ法计算ＩＣ５０值。

　　１．２．２ 流式细胞仪检测细胞周期 在六孔板中加入细胞（０．５ × １０５ ～ １ × １０５／孔），细胞长至７０％左右融合度时用无血清的培养基同步化处理２４ ｈ。加入１０ ｎｇ／ｍＬ浓度的雷帕霉素，置于含有１００ ｍＬ／Ｌ胎牛血清的ＲＰＭＩ １６４０培养基中于３７℃，体积分数５％ ＣＯ２条件下继续孵育２４ ｈ。吸取细胞及培养基至离心管，８００ ｒ／ｍｉｎ（ｒ＝５ ｃｍ）离心５ ｍｉｎ，弃去上清，加入１ ｍＬ ＰＢＳ重悬，８００ ｒ／ｍｉｎ（ｒ＝５ ｃｍ）离心５ ｍｉｎ，弃去上清，再次加入１ ｍＬ ＰＢＳ重悬，按细胞周期流式细胞仪检测试剂盒说明书操作上机获取。

　　１．２．３ 实时荧光定量ＰＣＲ检测ＶＥＧＦｍＲＮＡ表达 在六孔板中加入细胞（０．５ × １０５ ～ １ × １０５／孔），置于含有１００ ｍＬ／Ｌ胎牛血清的ＲＰＭＩ１６４０培养基中于３７ ℃，体积分数为５％ ＣＯ２条件下孵育１２ ｈ后，加入浓度为１０ ｎｇ／ｍＬ的雷帕霉素，继续孵育２４ ｈ。在培养板每孔中加入１ ｍＬ ＴＲＩＺＯＬ抽提ＲＮＡ，按ＫＥＹＧＥＮ公司的逆转录说明书并逆转录为ｃＤＮＡ。选择ＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡ模板进行ＰＣＲ反应，制备用于绘制标准曲线的梯度稀释ＤＮＡ模板。根据绘制的梯度稀释ＤＮＡ标准曲线，各样品目的基因和管家基因的浓度结果直接由机器生成。每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度，即为此样品此基因的校正后的相对含量。平行检测３次，求其平均值代表表达水平。

　　１．３  体内实验

　　１．３．１ 肝癌肝移植术后肝癌复发大鼠模型 建立大鼠肝癌肝移植术后肿瘤复发模型［２］，用２９号针头将事先配好的ｗａｌｋｅｒ-２５６肿瘤细胞悬液 （１０６／０．５ ｍＬ）吹吸混匀后，经肠系膜上静脉接近汇合部直视下注入。

　　１．３．２ 分组及用药方案 ４０只大鼠肝转移癌大鼠模型按实验设计随机等分为实验组、对照组（每组２０只）。实验组：免疫抑制方案为ＭＰ ＋ ＣＳＡ ＋ ＳＲＬ，即术前术后每天经大鼠尾静脉注射甲泼尼龙琥珀酸钠２０ ｍｇ／ｋｇ，术前及术后每天经大鼠尾静脉注射环孢素Ａ（２０ ｍｇ／ｋｇ），雷帕霉素（１．５ ｍｇ／ｋｇ）灌胃管灌胃。通过联合免疫抑制方案模拟同种异体肝移植术后免疫抑制状态。对照组：免疫抑制方案为ＭＰ ＋ ＣＳＡ，用药方法同实验组。

　　１．３．３ 术后处理 术后复温至苏醒，置于ＳＰＦ环境，分笼单独饲养，自由进食饮水。术后７ ｄ内，实验组及对照组大鼠每天均注射青霉素钠１０万Ｕ／ｋｇ以预防感染。死后探查肝脏，标本做常规切片病理检查，６０ ｄ后将余下动物处死。

　　１．３．４ 增殖细胞核抗原ＰＣＮＡ检测 采用免疫组织化学ＳＰ法。观察每个切片１０ 个高倍视野（×４００）中肿瘤增生活跃区的肿瘤细胞，计数１ ０００ 个细胞，增殖细胞核抗原（ｐｒｏｌｉｆｅｒｅｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｎａｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ，ＰＣＮＡ）阳性染色为细胞核膜周围及核内被染成棕黄色，呈颗粒状或弥漫样；阴性则无此着色。记录阳性细胞数，阳性率即为ＰＣＮＡ 标记指数（ＰＣＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｉｎｄｅｘ，ＰＣＮＡ ＬＩ） 。

　　１．４  统计学分析

　　计量资料数据均以ｘ ± ｓ表示，使用ＳＰＳＳ １３．０软件包进行分析。生存分析根据Ｋａｐｌａｎ-Ｍｅｉｅｒ法作出生存曲线，生存期比较采用Ｌｏｇ ｒａｎｋ法。复发率比较使用Ｆｉｓｈｅｒ?蒺ｓ确切概率法进行比较。计量资料比较当方差齐时使用两组完全随机化设计资料均数的ｔ检验，方差不齐时采用两组完全随机化设计资料均数的ｔ′检验。统计分析Ｐ ＜ ０．０５定义为有显著性差异。

　　２  结果

　　２．１  ＭＴＴ法检测雷帕霉素对体外培养肿瘤细胞活力的影响

　　如图所示，雷帕霉素对Ｗａｌｋｅｒ-２５６肿瘤细胞生长有明显抑制作用，其ＩＣ５０为９．６０ ｎｇ／ｍＬ。

　　２．２ 流式细胞仪检测雷帕霉素对ｗａｌｋｅｒ-２５６肿瘤细胞细胞周期影响

　　如表１所示，雷帕霉素处理的ｗａｌｋｅｒ-２５６肿瘤细胞组Ｇ１／Ｇ０期细胞比例明显增加。

　　２．３  实时荧光定量ＰＣＲ的检测

　　如表２所示，雷帕霉素处理的ｗａｌｋｅｒ-２５６肿瘤细胞组ＶＥＧＦｍＲＮＡ相对表达量明显减少。

　　２．４  肿瘤复发情况

　　肿瘤复发者大体标本见肝脏肿瘤浸润程度由多个点状浸润灶到广泛浸润、肝明显增大不等。实验组大鼠肿瘤主要表现为点状浸润，对照组则主要以广泛浸润为主。镜下检查见明显异形性肿瘤细胞，瘤细胞间形态差异小，成团灶样分布，散布于各肝叶，被侵犯的肝内组织结构破坏。６０ ｄ内统计，实验组大鼠肿瘤复发率为９０％（ｎ＝２０）与对照组９５％（ｎ＝２０）比较，差异无统计学意义（Ｆｉｓｈｅｒ?蒺ｓ ｅｘａｃｔ ｔｅｓｔ，Ｐ＝０．５０）。

　　２．５  荷瘤大鼠生存分析

　　如图所示，实验组生存时间（２６．５ ± ２．５）明显长于对照组（１４．８ ± ２．３），差别有统计学意义（Ｌｏｇ Ｒａｎｋ法?字２＝２３．４２８，ｄｆ＝１，Ｐ ＜ ０．０５）。

　　２．６  增殖细胞核抗原ＰＣＮＡ检测  　　实验组ＰＣＮＡ指数为６４．１％ ± ２．１％，明显较对照组８０．８％ ± １．０％为低，差别有统计学意义（ｔ′-ｔｅｓｔ，ｔ＝７．１３３，Ｐ ＜ ０．０５）。

　　３ 讨论

　　肝癌肝移植术后肿瘤复发是目前肝移植研究的热点问题之一［３－７］，原位肝移植理论上可以在切除硬化肝脏的同时彻底切除肝癌，是治疗肝癌的理想手段，但肝癌肝移植术后的肝癌复发影响了肝癌肝移植的远期疗效。肝移植术后免疫抑制药物的应用会干预机体免疫系统的免疫监视功能进而加速甚至促进肝癌的复发［８］。目前认为雷帕霉素对裸鼠种植皮下瘤肺转移有抑制作用［９］，但裸鼠的免疫状态与肝移植术后使用免疫抑制药物的大鼠免疫状态有较大的差异，而且肝癌肝移植术后大多数肿瘤细胞脱落、迁移的发生是在使用雷帕霉素以前，与皮下移植瘤肺转移机制不一致。故雷帕霉素对肝癌肝移植术后肿瘤复发的影响作用尚不清楚。

　　本实验ＭＴＴ结果表明雷帕霉素能有效抑制肿瘤细胞生长、增殖。同时，流式细胞仪检测其细胞周期变化也表明，加入雷帕霉素体外培养的肿瘤细胞大多分布于Ｇ０／Ｇ１期。这与新型免疫抑制剂雷帕霉素与Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｔａｒｇｅｔ ｏｆ Ｒａｐａｍｙｃｉｎ结合，阻断Ｔ 淋巴细胞及其他细胞由Ｇ１ 期至Ｓ 期的进程有关，此外雷帕霉素还能增加ｐ２７ＫＩＰ１及Ｅ-ｃａｄｈｅｒｉｎ的表达，从而阻断了细胞的分化和增殖，使细胞停滞于Ｇ１期［１０］。由此推断，雷帕霉素可通过ｍＴＯＲ途径改变肿瘤细胞的增殖周期，抑制肿瘤细胞生长。

　　增殖细胞核抗原（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ，ＰＣＮＡ）含量和表达强弱的变化与ＤＮＡ 合成及ＤＮＡ 复制的活跃程度一致。可作为反映肿瘤细胞的增殖速度或受抑制状态的指标［１１］。本实验结果显示，实验组大鼠ＰＣＮＡ表达明显低于对照组大鼠。提示在联合免疫抑制方案中使用雷帕霉素后肿瘤细胞增殖受到明显抑制，增殖速度减慢。另外，实验组的荷瘤大鼠标本浸润较轻，肝重及肝重比明显较对照组小，提示使用雷帕霉素可抑制肿瘤生长。

　　目前体外细胞培养研究表明，雷帕霉素通过抑制细胞增殖、抑制侵袭性表型的转化、从而抑制肿瘤细胞运动转移［１２］。有实验表明，免疫抑制肝转移癌大鼠模型肿瘤复发率明显较不使用免疫抑制的模型者高［２］，而本实验中实验组大鼠肿瘤转移复发率与对照组大鼠比较无统计学差异，提示在本模型采用联合雷帕霉素的免疫抑制方案并不能完全消除因联合免疫抑制下调免疫监视功能而对肿瘤复发造成的影响，对肿瘤复发率的降低无明显作用。

　　而对两组大鼠Ｋａｐｌａｎ-Ｍｅｉｅｒ生存分析表明，虽然复发率并无明显改善，但是加用雷帕霉素的实验组大鼠生存期明显较传统联合免疫抑制方案的对照组长，提示雷帕霉素的加入虽然不能降低肿瘤复发率，但是可有效延长免疫抑制状态下大鼠的荷瘤生存期。组织病理切片的ＰＣＮＡ指数表明对照组肿瘤组织明显较雷帕霉素组增殖活跃，而体外ｗａｌｋｅｒ-２５６肿瘤细胞培养相关检测亦表明，雷帕霉素组大量肿瘤细胞停滞于Ｇ１／Ｇ０期，肿瘤细胞生长受抑。此外，体外实验亦表明，雷帕霉素可下调肿瘤细胞Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｍＲＮＡ表达，抑制促肿瘤血管生长因素，从而抑制肿瘤血管生成。其具体机制仍有待进一步阐明。故推断这与雷帕霉素抑制免疫细胞的同时，也抑制已成功黏附滞留的肿瘤细胞增殖及瘤性血管生成，延长了肿瘤增殖、生长、扩张的过程所需时间，从而延长宿主荷瘤生存期。

　　虽然雷帕霉素对降低免疫抑制下的肿瘤复发率作用不明显，但能明显抑制肿瘤生长速度。因此对于移植术后发生肿瘤复发者，使用雷帕霉素可延长带瘤生存时间。而雷帕霉素使用的时机、方案以及剂量调整对肿瘤复发及荷瘤生存期的影响仍有待进一步研究。

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