胃癌癌周微淋巴管与淋巴道转移的关系及其意义
发表时间：2009-06-24 浏览次数：535次
作者：徐静，项锋钢 作者单位：青岛大学医学院,山东 青岛 266071 人体显微结构学实验室；病理学教研室
【摘要】 目的 探讨胃癌癌周微淋巴管与淋巴道转移的关系及其与临床病理特征之间的关系。方法 采用微淋巴管特异标记物Podoplanin标记微淋巴管，用Ki67检测微淋巴管内皮细胞的增殖活性，在一张切片上同时测定56例胃癌组织微淋巴管密度及其增殖活性，并结合胃癌临床病理特征进行分析。结果 胃癌癌周微淋巴管密度与肿瘤的分化程度、淋巴结转移以及淋巴管受累有关(F=14.96,t=4.51、4.11；P<0.05、0.01)。胃癌癌周微淋巴管内皮细胞Ki67指数仅与淋巴管受累有关系(t=3.73，P<0.01)。结论 胃癌癌周微淋巴管可能促进肿瘤淋巴道转移；胃癌癌周微淋巴管密度是评价其分化程度、淋巴结转移及淋巴管受累的有价值的指标。
【关键词】 胃肿瘤 淋巴转移 淋巴管生成 肾小球足突细胞膜黏蛋白
RELATIONSHIP BETWEEN PERIPHERAL MICROLYMPH VESSEL AND LYMPHATIC METASTASIS IN GASTRIC CARCINOMA AND ITS SIGNIFICANCE
XU JING, XIANG FENGGANG
(Human Micromorphology Lab, Qingdao University Medical College, Qingdao 266071, China);
［ABSTRACT］ Objective To investigate the relationship between surrounding microlymph vessels and lymphatic metastasis in gastric carcinoma. Methods The lymphatic micro vessel density (LMVD) in cancersurrounding area was detected in 56 cases and evaluated by immunohistochemistry, using monoclonal antibody for Podoplanin. The Ki67 expression of the lymphatic lining cells was detected at the same time by doublelabeling immunohistochemistry. The relationship between LMVD and clinic pathologic features was analyzed. Results The LMVD in cancer surrounding area was significantly correlated with differentiation, lymphatic involvement, and lymph node metastasis (F=14.96;t=4.51,4.11；P<0.05,0.01). The Ki67 labeling index of the lymphatic lining cells correlated only with that with lymphatic involvement (t=3.73,P<0.01). Conclusion The microlymphatic vessels may promote lymphatic metastasis, their density is of value in assessing the differentiation, lymph node metastasis and lymphatic involvement of the cancer. ［KEY WORDS］ Stomach neoplasms; Lymphatic metastasis; Lymphangiogenesis; Podoplanin 淋巴道转移是胃癌最常见和最重要的转移途径，也是影响病人生存的重要因素之一。长期以来，由于缺乏淋巴管特异性标记物，对肿瘤淋巴道转移的研究一直较为薄弱。新近研究表明，许多恶性肿瘤存在新生淋巴管,并与淋巴道播散与转移密切相关。胃癌局部淋巴结转移十分常见，其癌周微淋巴管与肿瘤淋巴道转移之间的关系和临床病理意义目前仍不清楚。Podoplanin是继VEGFR3后发现的又一特异性淋巴管内皮细胞标记物,且其特异性较VEGFR3更强[1]。本文采用Podoplanin标记胃癌组织的微淋巴管，同时用Ki67显示微淋巴管内皮细胞的增殖状态，即通过免疫组织化学双重标记法，在一张切片上同时显示微淋巴管及处于增殖状态的微淋巴管内皮细胞，结合临床病理资料进行综合分析，探讨胃癌癌周微淋巴管与淋巴道转移的关系及其临床病理意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取青岛大学医学院附属医院病理科2005年1～12月手术切除的胃癌存档蜡块56例，胃癌蜡块均包含取自于癌中央区（即癌内）癌组织和周围正常组织交界区（即癌周）的组织，所有病人手术前未接受过化疗和放疗。56例病人中男31例，女25例，年龄42～75岁，平均58岁。高分化腺癌8例，中分化腺癌20例，低分化腺癌28例。根据1987年国际抗癌联盟（UICC）PTNM分期标准分期,Ⅰ期＋Ⅱ期35例,Ⅲ期+Ⅳ期21例。肿瘤直径＞4 cm者24例，≤4 cm者32例。肿瘤浸润深度累及黏膜及黏膜下层者6例，累及肌层者18例，累及浆膜及浆膜外者32例。早期胃癌6例，中晚期胃癌50例。伴有淋巴结转移者27例，无淋巴结转移者29例。所有蜡块均行连续切片，厚度为5 μm。
1.2 胃癌癌周、癌内微淋巴管密度（LMVD）及微淋巴管内皮细胞Ki67指数的检测 用免疫组织化学双重染色方法。一抗分别为淋巴管内皮细胞特异性标记物Podoplanin和检测细胞增殖状态的抗体Ki67，分别购自Angiobio公司和北京中杉试剂公司。Histastain TMDS双染试剂盒购自Zymed公司。染色步骤如下：切片脱蜡，梯度乙醇水化，使用过氧化氢灭活内源性过氧化物酶,微波修复抗原，血清封闭，加一抗（Podoplanin，工作浓度为1∶200），加生物素化二抗，加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，用DAB显色，显微镜下监控，蒸馏水终止反应。加双染增强剂，再次微波修复抗原，血清封闭，加第二种一抗（Ki67，工作浓度为1∶100），加生物素化二抗，加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，用AEC显色，显微镜下监控，自来水终止反应，苏木精复染，使用水溶性封片剂Clearmount封片。以结肠癌切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。
1.3 结果判定 以阳性着色的单个内皮细胞或内皮细胞簇计为一个阳性微淋巴管，参照WEIDNER[2]的方法进行LMVD计数：首先在低倍镜下先选取阳性染色微淋巴管最密集区即“热点”，然后在200倍视野下计数LMVD，每例计数3个视野，最后求其均值。参考WULFF等[3]的方法，计数胃癌癌周微淋巴管内皮细胞Ki67指数。
2 结果
2.1 胃癌微淋巴管的染色情况 胃癌组织中可见到明确的Podoplanin阳性染色微淋巴管。微淋巴管被染为棕黄色，其内未见红细胞，少数微淋巴管内可见淋巴细胞。具有增殖活性的微淋巴管内皮细胞核及胃癌细胞核呈鲜红色。胃癌癌周及癌内组织均有微淋巴管分布，但其数目及形态有明显的异质性，癌周微淋巴管数目多且管腔多扩张，其LMVD为11.89±3.95；癌内微淋巴管数目少，多为闭锁的条索状，或呈狭长的裂隙状，其LMVD为5.83±3.26，癌周与癌内LMVD比较，差异有显著性(t=10.1,P<0.01)。有淋巴结转移的胃癌切片微淋巴管内可见癌栓，1例无淋巴结转移的胃癌切片微淋巴管内也发现癌栓。
2.2 胃癌癌内及癌周LMVD、微淋巴管内皮细胞Ki67指数与临床病理特征之间的关系 胃癌癌内LMVD在高、中、低分化胃癌分别为2.25±0.82、4.12±2.32及7.75±2.71，其中癌内的LMVD与肿瘤的分化程度有关（F=20.79，P<0.01），而与其他临床病理特征无关。胃癌癌内微淋巴管内皮细胞Ki67指数均为0，与肿瘤的临床病理特征无关。胃癌癌周LMVD与肿瘤的分化程度、淋巴结转移及淋巴管受累有关(F=14.96,t=4.51、4.11；P<0.05、0.01)，与病人的年龄、性别、肿瘤大小、浸润深度、临床分期及病情进展情况均无关。胃癌癌周微淋巴管内皮细胞Ki67指数仅与淋巴管受累有关(t=3.73,P<0.01)，与病人的年龄、性别、肿瘤大小、分化程度、临床分期、肿瘤浸润深度、病情进展情况及淋巴结转移均无关。见表1。
表1 胃癌癌周LMVD及微淋巴管内皮细胞Ki67指数与临床病理特征之间的关系（略）
3 讨论 上皮起源的肿瘤以淋巴道转移为主，且发生较早，但是到目前为止，关于肿瘤淋巴道转移的研究较少。随着特异、敏感的淋巴管标记物与特殊染色方法的出现，肿瘤淋巴道转移机制研究日益受到重视,成为继肿瘤血管生成机制研究的又一重点。Podoplanin是一种相对分子质量为43 000的肾小球足突细胞膜黏蛋白，参与足细胞足突的形成和塑形。以前认为它只表达于小淋巴管内皮，目前研究显示,皮肤某些血管内皮细胞也可以表达Podoplanin，但是其他器官和组织的血管内皮没有发现其表达。因此，认为该蛋白是目前较为理想的淋巴管标志物[4]。对于淋巴系统而言，Podoplanin只染色小的、由单层内皮衬托的微淋巴管，而有外周细胞或平滑肌细胞的大淋巴管，以及淋巴结的高内皮小静脉均不染色。郭嫦媛等[5]通过采用5′核苷酸酶（5′Nase）酶组织化学法及免疫组织化学法对胃肠标本进行研究，结果显示，应用Podoplanin进行免疫组织化学染色可以作为标记淋巴管的理想实验方法。本研究亦显示，Podoplanin标记的微淋巴管中均未见红细胞，肿瘤细胞也无免疫阳性染色，这说明Podoplanin可特异性标记微淋巴管，是研究肿瘤微淋巴管的特异性标记物。
3.1 胃癌癌周微淋巴管对淋巴道转移的作用 牟江洪等[6]采用Podoplanin Ki67，对96例结、直肠癌双标染色显示，肿瘤浸润边缘区LMVD增加与淋巴管受累和淋巴结转移密切相关，认为肿瘤边缘管腔扩张的淋巴管是结肠癌经淋巴道转移至淋巴结和远处脏器的主要通道，结直肠癌边缘区LMVD测定对判断其是否发生淋巴结转移可能有意义。李龙江等[7]研究显示，口腔癌癌周存在丰富的处于扩张状态的微淋巴管，认为可能是癌周组织间液的压强增高导致固着于结缔组织中的锚丝张力加大使微淋巴管扩张，其意义在于癌周淋巴管因极度扩张，内皮细胞连接方式由复杂型变为简单型，并大量出现开放状态导致微淋巴管与癌细胞接触的空间增加，从而为癌细胞顺利地进入淋巴管提供了解剖学条件。SCHOPPMANN等[8]用抗Podoplanin抗体及抗CD34抗体对45例浸润性乳癌标本的微淋巴管及微血管进行免疫组化染色，结果显示LMVD水平增高与淋巴管受累及腋淋巴结转移显著相关。肿瘤淋巴管生成是指在肿瘤原位形成新的毛细淋巴管，由于肿瘤新生淋巴管仅由单层内皮细胞组成，内皮细胞间的连接不紧密，缺乏连续的基膜，管壁薄，这些特点使得肿瘤细胞便于进入淋巴管道，进而形成淋巴结转移和远处转移[9]。 就肿瘤转移而言，更重要的条件是肿瘤组织中是否存在能促进肿瘤发生转移的淋巴管，PADERA等[10]认为肿瘤内部淋巴管对肿瘤转移的意义不大，而肿瘤周边的淋巴管有利于肿瘤细胞发生转移，这部分淋巴管可成为治疗肿瘤的靶点。本文结果显示，胃癌癌周微淋巴管内皮细胞Ki67表达增强，提示在胃癌癌周存在新生淋巴管。同时，胃癌癌周微淋巴管内皮细胞增殖活性（即内皮细胞Ki67指数）与淋巴管受累有关，淋巴管受累组Ki67指数大于淋巴管未受累组，两者比较差异有统计学意义。说明癌周新生的淋巴管可以促进肿瘤细胞进入淋巴管，形成癌栓或癌细胞团，从而为其转移进入淋巴结打下基础。同时本文结果显示，淋巴管内皮细胞Ki67指数与淋巴结转移无关，这是因为肿瘤新生淋巴管虽然是淋巴道转移所必需的条件之一，但是仅有淋巴管生成尚不足以导致淋巴结转移，淋巴结转移是一个复杂的问题。HE等[11]研究显示，高表达VEGFC的人肺癌N15细胞可诱导癌周淋巴管生成，但并不增加局部淋巴结转移。另外一个原因可能是即使肿瘤已转移至淋巴结，但常规病理苏木精伊红切片并未发现肿瘤的淋巴结转移，尤其是当淋巴结发生微转移时。我们在1例胃癌切片中发现淋巴管内有癌栓，但常规病理苏木精伊红切片并未发现病人淋巴结转移，因此用Podoplanin及Ki67进行双重免疫组织化学染色，可以更准确地显示肿瘤细胞是否侵犯淋巴道，与常规苏木精伊红染色比较，在提示肿瘤淋巴结微转移方面有一定的优越性。
3.2 胃癌癌周LMVD与临床病理特征之间的关系 彭正银等[12]报道，非小细胞肺癌癌周LMVD与肿瘤细胞分化程度、肿瘤PTNM分期及肿瘤淋巴结转移有关。谢志坚等[13]采用5′核苷酸酶法来显示口腔鳞癌癌周微淋巴管，发现癌周LMVD与肿瘤细胞的分化程度及颈淋巴结微转移相关。我们的研究显示，胃癌癌周及癌内LMVD与肿瘤的分化程度有关，肿瘤的分化程度越低，其癌周及癌内LMVD越高。分化程度低的肿瘤细胞可以产生更多的促淋巴管生成因子，从而导致癌周及癌内LMVD升高。胃癌癌周微淋巴管内皮细胞Ki67指数随着肿瘤分化程度的恶化呈现上升趋势，但差异无显著性。其原因可能在于淋巴管生成因子既可产生于癌细胞，又可产生于基质细胞，癌周微淋巴管的增殖活性取决于两者释放淋巴管生成因子的量，仅仅有分化程度低的肿瘤细胞对于淋巴管生成还是不够的。研究同时表明，胃癌癌周LMVD与淋巴结转移及淋巴管受累均相关，其原因在于癌周微淋巴管本身的结构特点使其更易被癌细胞侵入，淋巴管越丰富，与癌细胞接触的机会就越多，从而为癌细胞的转移提供了有利的通道。
综上所述，胃癌淋巴道转移是通过癌周微淋巴管进行的；癌周LMVD这一指标对评价胃癌的分化程度、淋巴结转移及淋巴管受累是一有价值的指标；结合Podoplanin及Ki67进行双重免疫组化染色，可以准确显示肿瘤淋巴管侵犯情况。
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