Iressa抑制高转移性人肝癌LCI,D20原位移植瘤的血管形成

　　作者：陈方国，王杰军，薛 琼，于观贞，侯 亮，郭子姮    作者单位：1.第二军医大学附属长征医院，上海 200070；2.复旦大学附属中山医院肝癌研究所，上海 200032

　　【摘要】  ［目的］ 探讨Iressa对人高转移肝癌模型LCI,D20血管形成的抑制作用。［方法］ 12只原位移植LCI,D20肿瘤裸鼠分为采用空白对照组(A组)及Iressa治疗组(B组)，用药28d后处死裸鼠，测量肿瘤质量，检测肿瘤组织微血管密度(MVD)。［结果］ 对照组肿瘤负荷平均为2.01/g，MVD平均为39.57个/HP；治疗组平均肿瘤负荷及平均MVD为1.18g、14.10个/HP，与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。［结论］ Iressa有抑制肝癌血管形成及肿瘤生长的活性。

　　【关键词】  肝肿瘤　血管形成　血管形成抑制剂　Iressa

　　Inhibitive Effect of Iressa on Angiogenesis in LCI,D20 Orthotopically Implanted High Metastatic Human Hepatocellular Carcinoma Model

    CHEN Fang,guo1, WANG Jie,jun1, XUE Qiong2, et al.

    (1.Changzheng Hospital of the Second Military Medical University, Shanghai 200070, China;

    2.Affiliated Zhongshan Hospital, Liver Cancer Institute of Fudan University, Shanghai 200032, China)

    Abstract: ［Purpose］ To explore the inhibitive effect of Iressa on angiogenesis of highly metastatic human hepatocellular carcinoma model of LCI,D20. ［Methods］ Twelve nude mouse via orthotopic implantation of LCI,D20 were randomized into two groups: control group (A group) and Iressa group (B group). Tumor mass and microvessel density (MVD) were measured at the 28th,day of treatment. ［Results］ The mean tumor mass were 2.01g and 1.18g in A and B group respectively. The mean MVD were 39.57/HP and 14.10/HP in A and B group respectively. There was significant difference between two groups(P<0.05). ［Conclusion］ Iressa inhibits the growth of tumor and angiogenesis of hepatocellular carcinoma.

    Key words: hepatic neoplsams; angiogenesis; angiogenesis inhibitor; Iressa

    1 材料与方法

    1.1 动物模型　

    6 周龄，体重18~20g，雄性Balb/C nu/nu 裸鼠购自中国科学院上海药物研究所，SPF(specific pathogen free)条件饲养。肿瘤源取于LCI,D20 原位移植传代瘤源。裸鼠用戍巴比妥钠腹腔麻醉, 左上腹横切口, 暴露肝脏, 无菌条件下将约1mm×1mm×1.5mm 肿瘤组织植入, 缝合固定于肝左叶实质内，全层关腹。术后继续饲养, 自由进食。

    1.2 药 物　

    Iressa 由上海市胸科医院韩宝惠教授提供，利用HPMC[羟丙基甲基纤维素，0.5%（w/v）]作为载体溶液配制5mg/ml的悬浊液，4℃保存。使用前先置于室温30 min，振荡使之分散均匀。

    1.3 实验分组及处理措施　

    12只原位移植LCI,D20 肿瘤裸鼠随机分为2组，每组6 只。A组为对照组，B组应用Iressa。移植1周后开始治疗。A组灌饲HPMC载体溶液0.2ml，每天1次，连续应用14d；B组灌饲HPMC Iressa溶液0.2ml，每天1次，连续应用14d。终止治疗时间为移植后5周。

    1.4 肿瘤负荷计算

    裸鼠处死后，收集并记录在肝脏、腹腔、肺脏的肉眼可见的瘤灶（＞1mm×1mm)，称取瘤重总和即为该裸鼠的肿瘤负荷。

    1.5 微血管密度（MVD）计算

    以Rat anti,CD34 1：50为一抗，以Envision(rat)为二抗进行免疫组织化学染色，先在低倍显微镜下(×100) 观察切片,寻找肿瘤内血管高密度区,以肿瘤区内染成棕褐色单个内皮细胞或内皮细胞簇作为一个微血管计算,凡管腔大于8个红细胞大小,带有肌层的血管不予计数,然后在高倍显微镜下(×400) 随机计数5 个视野,取平均数作为该病例的MVD 值。

    1.6 统计学处理　

    采用SAS软件进行统计学分析，对A、B组做均数比较。

    2 结 果

    2.1 对照组肿瘤生长情况　

    接种后的第35d处死裸鼠，剖腹发现肿瘤体积增加，HE染色可见粗大的血管由周围长入肿瘤内，并有坏死灶。肿瘤负荷平均为2.01g，MVD平均39.57个/HP。图1中箭头所指为瘤体；图2中管状结构为肿瘤新生血管。

    2.2 Iressa对肿瘤血管形成的抑制作用　

    Iressa对肿瘤生长有抑制作用（图3，4）。在裸鼠处死时平均瘤重1.18g，平均MVD14.10个/HP，与对照组比较，差异均有显著性(P<0.05)。

    3 讨 论

    分子靶向治疗是指在肿瘤分子生物学的基础上，将与肿瘤相关的特异分子作为靶点，利用靶分子特异制剂或药物进行治疗的手段[4~6]。人体大部分肿瘤的发生发展和转移复发都依赖于病理条件下的血管生成[7，8]。因此，抑制肿瘤介导的血管生成为肿瘤治疗提供了一个非细胞毒性的新途径，抗血管生成疗法能够提高抗肿瘤治疗的效果，且并不增加其副作用[9]。血管生成是一个受众多正性或负性调节因子调节的复杂生理过程，其中血管内皮生长因子（VEGF）是目前已知作用最强、专属性最高的促血管生成因子[10]。

    目前靶向VEGF及其受体的抑制剂很多，研究较多的是VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂及VEGF单克隆抗体，前者属于小分子抑制剂，具有口服易吸收、剂量小，可长期用药等优点，包括SU5416、SU6668、ZD4190、ZD6474、PTK787等均已进入临床试验。

    表皮生长因子受体（EGFR）是一种跨膜糖蛋白，由细胞外特异性配体结合部分、穿细胞膜部分、具酪氨酸激酶活性的细胞内部分组成。EGFR在所有表皮来源性正常组织的细胞中均有表达，大约1/3的人体肿瘤过度表达EGFR，尤其是头颈部鳞状细胞癌（80%~100%）、结肠癌（25%~77%）、胰腺癌（30%~95%）、非小细胞肺癌（40%~80%）、肾癌（50%~90%）和乳腺癌（14%~91%）等[11~13]。

    表皮生长因子（EGF）、转化生长因子,α（TGF,α）等多种配体可与EGFR胞外部分结合，将有丝分裂信号向胞内传递，从而调控细胞周期，调节细胞生长与分化，促进损伤修复，EGFR还可活化其下游的血管内皮生长因子受体（VEGFR），促进实体瘤微血管网形成，因此EGFR在肿瘤细胞的发生发展、分化、修复及转移中发挥重要的作用[14]。

    临床前研究表明，靶向作用于这些酪氨酸激酶的药物能够阻断EGFR激活，进而阻断后续的细胞内事件。阻断EGFR 酪氨酸激酶的化合物能抑制表达EGFR 的肿瘤生长，使过表达EGFR 的肿瘤缩小。这些药物还能降低血管内皮生长因子水平，促进凋亡[15]。本实验中应用的Iressa（gefitinib，ZD1839）是一种可口服的EGFR酪氨酸激酶小分子抑制剂，可抑制非小细胞肺癌（NSCLC）和其他肿瘤如结直肠癌、头颈部癌、前列腺癌、乳腺癌细胞的生长及存活，其可能的机制包括：①竞争EGFR,TK催化区域上Mg,ATP结合位点，阻断其信号传递；②抑制有丝分裂原活化蛋白激酶的活化，促进细胞凋亡；③抑制肿瘤血管生成[16~18]。

    肿瘤血管不仅提供了肿瘤生长所需的营养，而且也是癌细胞播散的途径[19，20]。微血管密度(microvessel density，MVD) 被认为一种反映肿瘤血管生成的重要指标。研究证实肝癌内微血管化程度越高的区域，VEGF表达也高，提示VEGF在肝癌微血管形成过程中发挥重要作用,是重要的肝癌血管形成促进因子[21，22]。Kwak等[23]研究了VEGF 表达与肝癌肿瘤血管的CT表现之间的关系，发现肝癌CT动脉期强化越强，肝癌组织VEGF 表达水平越高，也证实了以上观点。这就为肝癌的对于血管形成的靶向治疗提供了理论依据。

    本实验中所用动物模型LCI,D20 是复旦大学肝癌研究所建立的人肝细胞癌（HCC）高转移裸鼠模型，移植瘤的生长和侵袭转移规律为：LCI,D20模型潜伏期为一周，第二周开始呈肝内侵袭性生长，与肝实质无明显分界，第四周移植瘤突破肝表面向肝外生长，第五周肝外形成明显的突出肝表面的瘤结节并侵犯胃肠道、肠系膜、网膜、膈肌和腹壁，有的突破腹壁肌层在皮下生长，第六周移植瘤直径可达2.5cm，形成腹内肿块、外观明显可见；与移植瘤生长伴行的侵袭转移始于第二周，以肝血管内瘤栓为特征，肝血管系统的播散的后果是远处血行转移和淋巴道转移，于第三周可见肺脏血管内瘤栓和肝门淋巴结转移。肺血管内转移标志全身转移开始，宿主因全身转移导致衰竭，出现体重下降和抗移植瘤侵袭能力降低，第四周转移发展迅速，第六周出现肉眼可见的肝内转移灶、多处淋巴结转移和肺内微转移瘤[24]。

    本实验中，LCI,D20在应用Iressa治疗后，肿瘤新生血管密度与对照组相比有所减少，说明Iressa对于人肝癌的血管形成是有抑制作用的；但实验中肿瘤标本中仍可发现新生血管形成，可能的原因是存在其他的肿瘤新生血管形成的途经。这也从另一个侧面解释了肿瘤的新生血管形成是一个多因素、多步骤、多基因参与的复杂过程。对于肿瘤新生血管形成的治疗也应该考虑联合用药的方案。实验中还发现，在Iressa抑制肿瘤血管形成的同时，LCI,D20的瘤重与对照组比较也是有所减小的，这也说明了肿瘤新生血管形成对于肿瘤发生发展的重要性。Iressa对模型肿瘤生长及血管形成均有抑制作用，可为以后肝癌临床的抗血管形成的靶向治疗提供理论依据。

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