胃癌 P-糖蛋白表达的临床意义及逆转策略

　　作者：杨易　综述 许沈华　审校    作者单位：1.浙江中医药大学生命科学院，浙江 杭州 310053；2.浙江省肿瘤研究所，浙江 杭州 310022

　　【摘要】 文章介绍胃癌多药耐药基因（MDR1）产物P-糖蛋白（P-gp）表达的临床意义，以及与其他标志物联合检测的关系，并针对P-gp耐药逆转策略等研究进展进行综述。

　　【关键词】 多药耐药　P-糖蛋白　胃肿瘤　逆转剂

　　胃癌为我国最常见的恶性肿瘤之一，早期发现率低，多数就诊时为进展期胃癌，单纯手术常难以根治,化疗已经成为综合治疗的方法之一。但是化疗的效果还不够理想。已知，多药耐药基因（MDR1）的扩增及其产物P-糖蛋白(P-gp)的过表达是化疗失败的直接原因之一，因此，检测胃癌P-gp表达，研究胃癌多药耐药的机制和寻找耐药逆转剂具有重要的临床意义[1]。

    1 P-gp 的耐药机制及检测方法

    P-gp 是由位于7q21 的MDR1 基因编码的产物，由1 280个氨基酸组成，分子量170 kD，故也称为p170糖蛋白，属于转运蛋白ATP结合家族[2]。P-gp跨膜结构具有能量依赖性“药泵”功能，能将疏水亲脂性药物，如长春新碱（VCR）、生物碱类、阿霉素（ADM）等泵出细胞外，造成细胞内药物浓度下降，使药物的细胞毒作用降低或完全丧失，同时还可以直接结合化疗药物，使药物无法进入细胞发挥作用，导致细胞产生耐药性。

    国内外有用基因芯片技术研究MDR1基因的扩增[3]。有用蛋白质斑迹法（Western blot）方法分析P-gp在胃癌细胞表达[4]。有用正电子发射断层扫描术技术来研究P-gp 的表达[5]。但大多数是用免疫组化技术研究P-gp 的表达[6，7]。也有用流式细胞术（FCM）检测胃癌细胞P-gp的表达[8~10]。认为FCM具有更快速、简便、准确的特点，适用于临床肿瘤化疗中预测P-gp相关抗药性。

    2 检测胃癌P-gp表达的临床意义

    2.1 胃癌P-gp表达与临床病理特征的相关性

    Gurel等[11]用免疫组化方法检测55例胃癌发现P-gp表达占87%（48/55），P-gp 表达程度越高则预后越差。张威等[12]用免疫组化方法检测101例胃癌、18例胃异型增生和20例正常胃黏膜，发现P-gp在正常胃黏膜、异型增生及未经化疗的胃癌组织中均有表达，且表达强度依次增加。正常胃黏膜内存在P-gp 的表达也说明人类本身存在MDR1基因表达，即自身具有抵抗药物的特性，肿瘤细胞的形成只是增加了这种抗药特性的表达。P-gp的表达强度还与胃癌的浸润深度、淋巴结转移、临床分期呈正相关，P-gp高表达，生存期短。Chen等[13]应用免疫组化及原位末端标记法（TUNEL）检测80例胃癌组织P-gp表达，发现P-gp阳性表达率为63.5%，也证实P-gp表达与临床分期有关(P＜0.05)，提示P-gp表达与肿瘤的侵袭有正相关倾向。但是在不同生存期患者肿瘤组织P-gp表达情况，差异无显著性(P＞0.05)。

    于佩瑶等[14]用免疫组化方法检测90例胃癌P-gp表达阳性率为66.7%，且与病理类型、分期、分化程度、淋巴结转移、年龄、性别无关，认为不宜作为恶性度指标，仅可作为化疗反应的独立预后因素。陈玉芳等[15]用免疫组化方法检测60例胃癌组织P-gp，表达率为58.39%，也发现其表达情况与组织分化程度、临床分期无关。蔡颖等[16]用免疫组化方法检测81例胃癌组织P-gp的表达，发现P-gp阳性表达率为58.02%，P-gp的高表达与胃癌的组织学类型、浸润深度和淋巴转移无明显相关性（P<0.05），提示P-gp作为一种多药耐药基因蛋白与胃癌的侵袭和发展无相关性。

    尽管现在对P-gp表达与临床病理特征相关性的报道存在不同结果，仍需积累更多病例研究证明其正确性。但从报道的大量文献看，检测P-gp有助于预测化疗敏感性，对选择合适的治疗方案和实施有效的逆转措施具有重要意义。在化疗前进行P-gp的检测，可以指导临床用药，以减少用药的盲目性。P-gp所介导的MDR化疗药物主要为长春花碱、长春新碱和阿霉素，尤其对长春花碱的耐药起决定性作用，因此认为P-gp阳性的胃癌患者选择化疗药物时应尽量避免使用脂性及生物碱类药物，选用与P-gp关系不大的烷化剂和抗代谢类药物。

    2.2 联合检测胃癌P-gp表达与其它标志物的关系

    2.2.1 与 p53表达的关系

    p53为抑癌基因。野生型p53基因位于人类第17号染色体短臂上,由393个氨基酸组成,分子量为53kD的核蛋白,通过控制细胞周期和诱导凋亡对细胞的生长起调控作用，能识别DNA损伤和修复DNA，以防止受损DNA复制和肿瘤形成。突变型p53基因往往导致细胞增殖，促进肿瘤形成。在50%以上的恶性肿瘤中可检测到突变型p53。

    黄伟等[5]用免疫组化方法检测105例胃癌组织p53和P-gp的表达，结果显示p53的阳性表达与P-gp的阳性表达密切相关（P<0.05）。p53蛋白阳性的肿瘤患者对某些化疗药物的敏感性较低，p53蛋白和P-gp的阳性表达是判断患者预后的重要指标之一。

    秦朝阳等[17]用免疫组化方法检测198例胃癌组织p53和P-gp的表达，发现p53蛋白阳性表达率为57% ，p53蛋白表达与胃癌组织学类型、淋巴结转移有关, 而与浸润深度、肿瘤部位无关。说明突变型p53过表达对癌细胞增殖抑制作用减弱，并促进癌细胞转移，提示p53蛋白表达阳性者其肿瘤恶性程度高，预后差。P-gp阳性表达率为58%，但与病理类型、分化程度、淋巴结转移无关。而P-gp阳性表达与p53蛋白阳性表达呈显著相关，认为通过联合检测，对胃癌的诊断、制订合理的化疗方案、判断预后有较大的临床意义。

    王岩等[18]用免疫组化方法检测46例胃癌p53和P-gp表达，发现p53蛋白阳性率为54.34%，P-gp阳性表达率为65.21%，当p53阳性表达时，P-gp阳性表达率为78.26%，有正相关性。研究表明，p53和P-gp表达之间有协同作用，基因转录水平研究发现突变型p53能增强MDR基因的表达，并通过抗细胞凋亡机制使肿瘤细胞产生耐药性。突变型p53能诱导MDR的表达，增强肿瘤细胞的耐药性。

    2.2.2 与环氧合酶-2表达的关系

    刘军等[19]用免疫组化方法检测40例胃癌组织环氧合酶-2(COX-2)和P-gp表达，发现 COX-2 表达阳性组中P-gp阳性表达率为82.8%，COX-2 表达阴性组中P-gp阴性表达率为63.2%，两者表达呈高度正相关(γ＝0.470，P<0.01)，表明COX-2与P-gp的表达存在某种联系。具体机制尚不清楚，推测COX-2 抑制剂可通过减少肿瘤的耐药性从而增强化疗药物的抗肿瘤作用。

    Nardone等[7]用免疫组化方法检测40例幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)阴性，50例Hp阳性治疗有反应和84例Hp阳性治疗无反应的病人，30例胃癌病人标本中的环氧合酶-2(COX-2)、mPGES1、P-gp和bcl-xL。发现Hp可能与胃癌的P-gp表达有关，Hp可以使肠型胃癌细胞内的 COX-2和mPGES1增高，间接引起P-gp和bcl-xL的高表达，从而导致胃癌的发生、发展和癌细胞产生耐药性。

    2.2.3 与 c-erbB-2表达的关系

    陶晓钰等[20]用免疫组化方法检测33例胃癌组织中P-gp和c-erbB-2的表达，显示c-erbB-2表达与P-gp表达呈正相关(P<0.05)，认为c-erbB-2与P-gp联合检测，可作为胃癌预后判断和选择抗癌药物的指标。

    蔡颖等[16]用免疫组化方法检测81例胃癌组织c-erbB-2和P-gp表达，结果显示c-erbB-2阳性表达组45例中P-gp阳性率为68.89 %(31/45)，P-gp高表达率在c-erb-2阳性组明显高于c-erbB-2 阴性组，差异有显著性(P<0.05)。提示c-erbB-2 阳性的肿瘤细胞存在着较高比例的原发性耐药，c-erbB-2是否介导了P-gp表达上调，从而使癌细胞产生较高的原发性耐药性，以及c-erbB-2 和P-gp两者间存在的内在联系及作用机制有待进一步研究。

    2.2.4 与TopoⅡ和GST-л表达的关系

    何松等[21]用免疫组化方法检测77例胃癌组织P-gp、GST-л和TopoⅡ的表达，P-gp、GST-л、TopoⅡ在胃癌组织中的阳性表达率分别为59.74%、67.53%和83.12%，在多项临床病理参数中，除组织学类型与TopoⅡ的表达强度有关外，其余各项均与P-gp、GST-л、TopoⅡ的表达强度无相关性。他们的研究还发现，管状腺癌、乳头状腺癌P-gp 和GST-л、的表达高于其他类型癌，而TopoⅡ的表达则明显低于其他型，这与临床上胃管状腺癌和乳头状腺癌对化疗药物易产生耐药，而神经内分泌癌、印戒细胞癌等对化疗较敏感的现象相符合。

    曲利娟等[22]用免疫组化方法检测85例胃癌组织P-gp、GST-л和TopoⅡ的表达。胃癌组织P-gp、GST-π表达率分别为37.65%及63.53%。P-gp表达强度与临床分期有关，晚期比早期P-gp表达高。TopoⅡ表达率为55.29%，阳性率与组织学分型相关，分化较低者(59.57%)比分化较高者(38.30%)表达高。发现检测胃癌P-gp、GST-л和TopoⅡ对化疗具有指导意义。P-gp 高表达对脂性、生物碱类、蒽环类等药物耐药；GST-π高表达对顺铂、阿霉素、5-Fu、丝裂霉素等耐药；TopoⅡ低表达主要对阿霉素、鬼臼乙叉苷耐药。临床上可根据胃癌P-gp、GST-л和TopoⅡ表达情况，有目的地选择抗肿瘤药物，以提高化疗效果。

    多药耐药是恶性肿瘤细胞免受化疗药物攻击的最重要的细胞防御机制。虽然，目前已认识到P-gp、GST-л和TopoⅡ对于肿瘤患者化疗方案的选择和预后判断具有重要的参考价值，但至今仍未完全探明肿瘤细胞多药耐药形成的详细机制。

    3 P-gp的逆转策略

    P-gp的逆转策略主要包括: ①使用P-gp 逆转剂，如S9788、XR9576，它们主要通过特异性或竞争性地与P-gp 结合来达到逆转目的；②免疫治疗，即利用特异性抗体封闭P-gp功能；③基因治疗，包括单链抗体技术、反义核酸技术、核酶技术和小分子干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)技术等，在DNA或RNA水平阻断MDR1的作用[23]。

    3.1 P-gp逆转剂

    目前，P-gp逆转剂已经发展到第三代。第一代逆转剂在体外试验中,可以甚至完全逆转肿瘤细胞耐药性。但在体内试验中，由于自身的剂量限制性毒性，不能达到体外有效逆转所需要的浓度。第二代逆转剂尽管在体内能够达到体外有效逆转耐药所需要的浓度，但限制其临床应用的主要障碍是当与抗肿瘤药物合用时，干扰后者的药代动力学。第三代逆转剂有S9788、GF120918、Zosuquidar (LY335979)、Lanquidar (R101933)、粉防己碱、ONT-093( OC144-093 )、XR9576 以及FG020326等。这些药物在与抗肿瘤药物合用时，不影响它们的药代动力学。S9788是近年来发现的新型氨基哌啶类逆转剂。已进行的临床Ⅰ期试验结果显示: S9788在发挥抑制P-gp 泵功能剂量下，与阿霉素之间无药代动力学方面的相互影响，不增加后者的毒性。Tariquidar (XR9576)是最有发展前景的第三代P-gp抑制剂之一，是通过高效且专一性地与P-gp结合而实现其逆转功能。XR9576与P-gp的亲和力非常高，在健康人体中的药代动力学研究表明：单剂量的XR9576 2mg/kg静脉滴注或者口服750mg能够被很好地耐受，而且完全逆转P-gp介导的多药耐药可以持续24h；并且不影响紫杉醇，vinorelbine和阿霉素的药代动力学。XR9576现在正在做有关非小细胞肺癌的Ⅲ期临床试验。有关XR9576与Docetaxel在治疗肺癌、卵巢癌和宫颈癌的Ⅱ期临床试验正在进行中[24]。

    3.2 免疫治疗

    针对多药耐药的免疫治疗原理应用P-gp特异性的单克隆抗体与P-gp结合，影响或阻断P-gp的药物转运功能，阻滞细胞内化疗药物的外流，使之充分发挥其细胞毒作用，从而达到逆转耐药的目的。MRK16是目前研究得比较多的P-gp单克隆抗体之一，其可以选择性地抑制多药耐药的肿瘤细胞，从而有效地阻断耐药性产生。到目前为止，采用单克隆抗体或免疫毒素来去除肿瘤细胞耐药性已经成为重要途径之一。

    3.3 基因治疗

    研究表明，肿瘤细胞产生多药耐药的最主要原因是MDR1 基因的过度表达，导致其编码蛋白P-gp的大量增加。因此，在基因水平逆转MDR是解决此问题的关键。利用反义寡聚脱氧核苷(ASODN)技术可以逆转P-gp表达。目前，应用基因治疗方法有肽核酸（PNA）技术、核酶技术以及细胞因子介导的基因治疗技术等。Kobayashi等[25]将抗MDR1的ASODN用RNA聚合酶Ⅲ增强子的逆转录病毒载体导入已过度表达P-gp的人白血病细胞株后，使其获得了对长春新碱的再敏感。他们又将6种逆转录病毒载体介导的携带有RNA聚合酶Ⅲ增强子的抗MDR 锤头状核酶导入P-gp过表达的人白血病细胞株,结果发现该细胞株中MDR1的表达、P-gp的含量和药物外泵的功能均被下调，该细胞株对长春新碱再度敏感。进一步的研究还发现，封闭转录起始部位时，抑制MDR1表达作用最强。Jun Zhou等[26]的最新报道通过增加JNK(c-Jun NH2-terminal kinase)剂量导入腺病毒载体方法可以降低P-gp水平来调控甚至逆转癌细胞耐药性。

    当然，目前针对MDR的基因治疗仍处于探索阶段，在基因载体的选择、靶基因在靶细胞内的特异性表达及基因治疗中生物安全性等方面还存在许多有待解决的问题。这些问题的解决将使基因治疗成为克服MDR最有效的手段之一[23]。

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