Notch1基因在人脑胶质瘤中的表达及其意义

作者：易海波，石松生，杨卫忠,陈春美

作者单位：350001 福州，福建医科大学附属协和医院神经外科(*现工作单位：363000 福建省漳州市医院神经外科)

   【摘要】  　　目的 研究Notch1在人脑胶质瘤中的表达，并对其表达与胶质瘤病理级别的关系进行研究，探讨Notch1对人脑胶质瘤发生、发展所起的作用，从而为胶质瘤的治疗提供一定的理论依据。方法 应用半定量RTPCR方法检测70例人脑胶质瘤标本和12例正常脑组织中的Notch1 mRNA的表达。结果 Notch1 mRNA在人脑胶质瘤和正常脑组织中均可表达，且在人脑胶质瘤中的表达显著高于正常脑组织（P<0.01）；人脑胶质瘤Ⅰ～ Ⅱ级组和Ⅲ～Ⅳ级组中Notch1 mRNA表达均显著高于正常脑组织（P<0.01），并且Notch1 mRNA在人脑胶质瘤Ⅲ～Ⅳ级组中的表达显著高于Ⅰ～ Ⅱ级组（P<0.01）。结论 Notch1 mRNA在人脑胶质瘤和正常脑组织中均表达，且在人脑胶质瘤中呈显著高表达，可能与人脑胶质瘤的发生、发展有关；Notch1的表达与人脑胶质瘤的病理分级相关。

【关键词】  Notch1　胶质瘤　RTPCR

　　The Expression and Significance of Notch1 Gene in Human Gliomas

    YI Haibo*，SHI Songsheng，YANG Weizhong,CHEN Chunmei

    Department of Neurosurgery,Union Hospital,Fujian Medical University,Fuzhou 350001,China(*Present:Department of Neurosurgery,zhangzhou Municipal Hospital,Zhangzhou 363000)Abstract：Objective   To study the expression of Notch1 in human gliomas and the correlation between the expression and the pathological grades of gliomas,to explore the role of Notch1 in the tumorigenesis and progression of human gliomas,accordingly to provide some proof of theory for treatment of human gliomas.Methods  The expression of Notch1 mRNA was detected in 70 primary human gliomas and 12 normal cerebral tissuses by using RTPCR semiquantity method.Results  The expression of Notch1 mRNA have been detected in human gliomas and normal cerebral tissuses and the expression level of Notch1 mRNA in human gliomas was considerably higher than those in normal cerebral tissuses(P<0.01);the expression level of Notch1 mRNA in gliomas of grade Ⅰ～Ⅱ      and      Ⅲ～ Ⅳ     was considerably higher than those in normal cerebral tissuses (P<0.01),and the expression level of Notch1 mRNA in gliomas of grade     Ⅲ ～Ⅳ      was considerably higher than those in gliomas of grade      Ⅰ～Ⅱ.Conclusion  The expression of Notch1 mRNA have been detected in human gliomas and normal cerebral tissuses,and the expression of Notch1 mRNA in human gliomas was considerably high,Notch1 may be involved in the tumorigenesis and progression of human gliomas;the expression of Notch1 may be correlation to the pathological grades of human gliomas.

    Key words：Notch1;Glioma;RTPCR

　 Notch信号通路是一个既简单又复杂的信号通路，且在多个物种中表达。Notch信号对于细胞的生长发育具有广泛的多样化的影响，包括干细胞的维持；细胞分化、增殖和凋亡的决定。1991年，Notch1在人类T淋巴母细胞白血病中首先被鉴定出来，首次提示了Notch信号通路与肿瘤相关[1]。许多体外及动物实验中已证实，活化的Notch可使正常细胞向恶性转化。已有越来越多的证据表明异常的Notch信号与一些人类肿瘤的发生发展相关。

本实验从基因水平，检测Notch1在各级别人脑胶质瘤和正常脑组织的表达情况。分析其与胶质瘤病理级别的相关性，探讨Notch1在人脑胶质瘤中的作用机制。

    1资料与方法

    1.1资料来源

    收集福建医科大学附属协和医院神经外科2004年1月～2005年9月手术切除的人脑胶质瘤新鲜标本70例，男39例，女31例，年龄2～92岁，平均40.3岁。按2000年WHO脑肿瘤分类标准：Ⅰ～Ⅱ级（低度恶性胶质瘤）34例，包括星形细胞瘤Ⅰ、Ⅱ级25例、室管膜下瘤1例、少突胶质细胞瘤4例、少突－星形细胞瘤4例；Ⅲ～Ⅳ级（高度恶性胶质瘤）36例，包括间变性星形细胞瘤15例、间变性少突胶质细胞瘤6例、间变性少突－星形细胞瘤6例、间变性少突胶质细胞瘤伴部分胶质母细胞瘤变2例、胶质母细胞瘤7例。通过内减压手术获得新鲜正常脑组织标本12例作为对照。

    1.2  主要试剂

    Trizol（Invitrogen公司），二步法RTPCR试剂盒（Promega公司），Taq DNA聚合酶（上海普洛麦格公司）。

    Notch1引物序列为利用Primier 5.0软件自行设计。

    Notch1：上游引物序列：5’CGT GCA GAG TGA GAC CGT GGA3’          下游引物序列：5’TGC GGT CTG TCT GGT TGT GCA3’

    扩增片断长度为599bp。

    βactin：上游引物序列：5’CGA GAA GAT GAC CCA GAT CA3’下游引物序列：5’GAT CTT CAT GAG GTA GTC AG 3’

    扩增片断长度为234bp。

    1.3  方法

    1.3.1采用TRIzol法提取组织总RNA取少量组织总RNA，琼脂糖凝胶电泳测试RNA完整。

    1.3.2按RTPCR kit（二步法）说明书进行cDNA的合成取1μg RNA至于PCR管，70℃孵育10 min后，稍离心放置冰上。加入MgCl2 4μl，10×Buffer 2μl，dNTP 2μl，RNasin 0.5μl，Oligo(dT)15引物 1μl，AMV反转录酶0.75μl，加ddH2O补足至20μl，将反应体系于42℃ 60min，95 ℃ 5min，4℃ 5min。

    1.3.3PCR反应体系cDNA 2μl，dNTP 0.9μl，MgCl2 3.75μl，10×PCR buffer 4.9μl，上下游引物（20pmol/μl）各1.25μl，Taq DNA聚合酶0.25μl，加ddH20补至50μl，混匀，离心。反应条件：94℃预变性5min;变性94℃ 30s，退火58℃ 40s，延伸72℃ 40s，共35个循环，最后72℃延伸10min。

    1.3.4取 PCR产物5μl，1.2%琼脂糖凝胶电泳（电压100V，时间25min）。将电泳凝胶置于凝胶图像分析系统（Gel Doc 2 000）半定量分析。

    1.4  统计学分析

    凝胶图像分析系统进行灰度分析，结果以±s表示，采用SPSS 13.0统计学软件进行统计学分析。

    2结果

    2.1总RNA完整性鉴定

    各组RNA均可见完整的18S和28S亚基，见图1。

    1：正常脑组织；2： Ⅰ级人脑胶质瘤；3：Ⅱ级人脑胶质瘤；

    4：Ⅲ级人脑胶质瘤；5：Ⅳ级人脑胶质瘤

    图1各组总RNA完整性鉴定

    2.2Notch1 RTPCR产物电泳结果

    70例人脑胶质瘤和12例正常脑组织均可见表达Notch1 mRNA，其RTPCR产物电泳结果，见图2。

    M：marker；1：正常脑组织；2：Ⅰ级人脑胶质瘤；3：Ⅲ级人脑胶质瘤

    图2Notch1 RTPCR产物电泳结果

    2.3四组实验病例的Notch1 mRNA表达水平

对照组和胶质瘤组行两样本t检验，得出P<0.01，表明人脑胶质瘤Notch1 mRNA表达显著高于正常脑组织。再将对照组、胶质瘤Ⅰ～Ⅱ级组和胶质瘤Ⅲ～Ⅳ级组行单因子方差分析（OneWay ANOVA），各组数据两两比较P均<0.01，表明胶质瘤Ⅰ～Ⅱ级和胶质瘤Ⅲ ～Ⅳ级中Notch1 mRNA的表达均显著高于正常脑组织，且Notch1 mRNA在胶质瘤Ⅲ～Ⅳ级中的表达显著高于胶质瘤Ⅰ～Ⅱ级，见表1。表1  四组实验病例的Notch1 mRNA表达水平注：两样本t检验分析*组与**组比较，P<0.01；方差分析*组、***组和****组，两两比较P均<0.01

    3  讨论

    近年来Notch信号在胶质瘤增殖存活中的作用日益受到关注。目前，在宫颈癌[2,3]、结肠癌[3]、肺癌[3]、胰腺癌[4]、皮肤癌[1]等人类实体瘤中均发现Notch1蛋白高表达。有效的证据已经显示肿瘤中Notch信号通路经常失调。许多肿瘤与Notch受体表达异常有关，Notch信号通路在细胞增殖分化及凋亡中有重要作用，是许多重要细胞信号通路的交汇点，以Notch受体为靶点的肿瘤基因治疗及新药开发将为肿瘤治疗的研究开辟新领域。已有初步研究显示以Notch作为抗肿瘤靶点具有良好的应用前景。目前阻断Notch信号通路策略分为两类:有选择性的以Notch受体为靶点的抑制策略和非选择性的抑制策略。前者包括应用反义RNA[5]、RNA干扰[6]和单克隆抗体[7]。后者包括了Notch配体封闭剂[8]和γsecretase抑制剂[9]等。

    我们目前的结果显示：Notch1 mRNA在人脑胶质瘤和正常脑组织中均可表达，且在人脑胶质瘤中的表达显著高于正常脑组织（P<0.01），这说明Notch1的表达水平可能与人脑胶质瘤的发生、发展有关；人脑胶质瘤Ⅰ～Ⅱ级组和Ⅲ～ Ⅳ级组中Notch1 mRNA表达显著高于正常脑组织（P<0.01），并且Notch1 mRNA在Ⅲ～Ⅳ级组中的表达显著高于Ⅰ～Ⅱ级组（P<0.01），这说明Notch1的表达水平与人脑胶质瘤的病理级别相关，与人脑胶质瘤的恶性程度相关。

    Notch1与肿瘤的关系是复杂的。Notch1既具有促癌作用，也具有抑癌作用。Purow等[6]通过RNA干扰技术使Notch1 siRNA转染给所有6种人脑胶质瘤细胞系，使用流式细胞术和细胞周期分析显示胶质瘤细胞显著凋亡和增殖抑制。且在鼠的常位脑肿瘤模型中，已植入转染Notch1 siRNA 的U251MG细胞的鼠与对照组相比其生存时间显著延长。结合Purow的实验结果，可以推断Notch1对人脑胶质瘤的发生和发展是起促进作用的，并可表明Notch1可以作为人脑胶质瘤治疗的新的靶点。

    总之，本研究结果显示，Notch1过表达可能与人脑胶质瘤的发生、发展有关，并与人脑胶质瘤恶性程度相关。可以预言，随着对Notch1与人脑胶质瘤关系及其Notch1在人脑胶质瘤发病机制中作用的研究，Notch1作为人脑胶质瘤治疗的新的靶点具有一定的应用前景。

【参考文献】  　　［1］ Nickoloff BJ,Osborne BA,Miele L.Notch signaling as a therapeutic target in cancer: a new approach to the development of cell fate modifying agents[J].Oncogene,2003,22(42):65986608.

[2] Gray GE,Mann RS,Mitsiadis E,et al.Human ligands of the Notch receptor［J］.Am J Pathol,1999,154(3):785794.

[3]Zagouras P,Stifani S,Blaumueller CM,et al.Alterations in Notch signaling in neoplastic lesions of the human cervix[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1995,92(14):64146418.

[4]Miyamoto Y,Maitra A,Ghosh B,et al.Notch mediates TGF alphainduced changes in epithelial differentiation during pancreatic tumorigenesis[J].Cancer Cell,2003,3(6):565576.

[5]Weijzen S，Zlobin A，Braid M，et al.HPV16 E6 and E7 oncoproteins regulate Notch1 expression and cooperate to induce transformation[J].J Cell Physiol,2003,194(3):356362.

[6]Purow BW,Haque RM,Noel MW,et al.Expression of Notch1 and its ligands,Deltalike1 and Jagged1,is critical for glioma cell survival and proliferation[J].Cancer Res，2005，65(6):2353 2363.

[7]Yasutomo K，Doyle C，Miele L，et al.The duration of antigen receptor signalling determines CD4+ versus CD8+ Tcell lineage fate[J].Nature,2000,404(6777):506510.

[8]Nickoloff BJ,Qin JZ,Chaturvedi V,et al.Jagged1 mediated activation of notch signaling induces complete maturation of human keratinocytes through NFkappaB and PARgamma[J].Cell Death Differ,2002,9(8):842855.

[9]Fan X,Mikolaenko I,Elhassan I,et al.Notch1 and notch2 have opposite effects on embryonal brain tumor growth[J].Cancer Res,2004,64(21):77877793.