自主细小病毒抗肿瘤作用研究进展

    作者：李方    作者单位：解放军总医院，北京 100853

    【摘要】  自主细小病毒宿主广泛，对肿瘤细胞和转化细胞有选择性杀伤，具有亲瘤性和溶瘤性，迄今未发现对人类有致病性，非常有希望成为一个新的抗肿瘤制剂。全文综述细小病毒的结构和功能、抗肿瘤作用及机制、易感性、致病性等方面的研究进展。

    【关键词】  自主细小病毒

   1   病毒抗肿瘤治疗概述

    一百多年以前人们开始利用各种野生型病毒能够溶解肿瘤的特性治疗癌症，但在上世纪60年代由于毒性问题此方法一度被放弃。DNA重组技术的发展，使得人们可以通过基因操作来增强病毒的肿瘤特异性从而使得安全性大大提高，基因治疗一度成为人们战胜癌症的希望所在。从1990年到2004年间共有1 020项基因治疗临床实验，其中675项（66%）是治疗癌症，675项中一部分基因治疗应用的是非溶细胞性病毒如逆转录病毒、腺病毒相关病毒、质粒DNA、脂质体转染、基因枪等方法。另外一半以上是溶瘤病毒治疗，包括通过基因改造获得肿瘤选择性的腺病毒、单纯疱疹病毒和痘苗病毒等三个DNA病毒以及2个野生型肿瘤特异性的RNA病毒——新城疫病毒和呼吸道肠道过滤性病毒[1]。其中中国上海三维公司研制的腺病毒H101/ONYX-015于2005年获得SFDA批准，成为第一个溶瘤病毒药物。

    以上恶性肿瘤的病毒治疗无外乎通过三种方式：一是病毒作为转基因载体转导治疗性基因，二是病毒直接溶解肿瘤，三是结合病毒的溶瘤特性和转导的治疗性基因的特性进行溶瘤—基因治疗[2，3]。

    病毒载体转基因治疗存在的载体系统转染效率低、目的基因表达量低等问题一直没有得到根本的解决，此外基因操作难、病毒滴度低、残存的野生型病毒感染静止细胞等问题也影响治疗效果[1]。因此，采用无需进行基因操作，又具有肿瘤特异性，对正常细胞无影响、无致病性、无毒、有效的病毒直接杀伤肿瘤将是最理想的方式。

    在恶性肿瘤细胞内具有复制能力的溶瘤病毒除了以上提到的腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒、新城疫病毒、呼吸道肠道过滤性病毒外，还有水泡性口膜炎病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、细小病毒等[4]。但腺病毒、单纯疱疹病毒和脊髓灰质炎病毒会损伤非转化细胞或诱导炎症反应，新城疫病毒NDV PV701有剂量依赖性的毒性。

    人们研究细小病毒的历史还不长，但已有的研究结果表明细小病毒是DNA病毒中惟一没有致瘤成员的病毒。而且细小病毒只在肿瘤细胞内发挥毒性作用：即对肿瘤细胞和转化细胞有选择性杀伤，而对正常细胞则无影响，具有亲瘤性和溶瘤性，不整合到宿主的染色体中，没有插入突变的风险，迄今未发现对人类有致病性，因此非常有希望成为一个新的抗肿瘤制剂。

    2   细小病毒H-1的结构

    感染脊椎动物的细小病毒有腺病毒相关病毒（AAV，依赖病毒属，病毒复制需辅助病毒），自主细小病毒（细小病毒属如大鼠细小病毒H-1、小鼠细小病毒MVM和红细胞病毒属人红细胞细小病毒B19等）。细小病毒H-1的天然宿主为大鼠，与其他啮齿类细小病毒（如MVM，LuⅢ和大鼠病毒RV）一样，H-1可以在包括人类的多种细胞内复制。它的复制发生在细胞周期的S期，依赖宿主细胞的酶系，其复制循环包括吸附、进入、复制、组装和释放五个步骤。病毒的吸附和进入可发生在任何时候，但病毒基因的复制需要细胞周期S期特异的相关因子，并和细胞的增殖分化状态有关[5]。

    细小病毒H-1基因组有2个启动子，P4和P38。P4指导病毒非结构蛋白NS1和NS2的合成，P38指导外膜蛋白VP1和VP2的合成。NS1是一个多功能的蛋白，具有解旋酶、核酸内切酶、ATP酶、DNA-nicking和序列特异性DNA结合活性，既可控制病毒DNA的复制和表达，还具有细胞毒性作用[5]。见图1。

    3   细小病毒H-1的抗肿瘤活性

    H-1不仅能抑制动物自发肿瘤的发生，也能抑制诱发肿瘤。众多的研究证明H-1对各种类型的肿瘤（肉瘤、癌、白血病），不同诱因（DNA和 RNA肿瘤病毒，化学致癌剂）以及人和动物（鼠、犬）的肿瘤均有抑制作用[5]。在体外的实验系统中，H-1亦有明显的抗瘤活性，如转化的纤维母细胞和上皮细胞、人鼻咽癌细胞、人胃癌及肝癌细胞等对H-1均敏感[6]。但转化细胞对细小病毒的敏感性是不同的，与细胞类型以及转化诱导剂都有关系。H-1以及RV、MPV-1、RPV-1等啮齿类细小病毒对淋巴类组织表现很强的趋向性，提示这类病毒可用来治疗造血系统的肿瘤。体外实验也证实一些人白血病和淋巴瘤细胞系对H-1病毒非常敏感。大多数啮齿类细小病毒对内皮细胞来源的肿瘤也具有强趋向性，提示血管肿瘤和血管增生也可能成为H-1病毒治疗的靶子。H-1病毒还可以体外感染和杀伤转化的人成纤维细胞和上皮细胞，在SCID小鼠体内抑制人Hela移植瘤的生长[7]，对大鼠胶质瘤细胞系和短期培养的人原代恶性胶质瘤、神经胶质瘤细胞有很强的剂量依赖性的杀伤作用[8，9]。

    细小病毒的抗肿瘤活性一方面表现为直接的毒性作用，另一方面表现为免疫系统介导的抗肿瘤作用。细小病毒的直接细胞毒性作用主要由病毒非结构蛋白NS1产生，NS2可调节NS1的作用。体内试验表明在坏死的肿瘤组织周围有大量NS1表达。Geletneky K等研究了H-1对恶性胶质瘤的毒性作用与病毒的复制和感染性病毒颗粒产生有关。Cornelis JJ的研究表明，H-1不经过完整的病毒复制周期也可产生细胞毒性作用， 证实H-1的抑癌作用不仅可以通过病毒在肿瘤细胞中的大量复制溶解肿瘤，还可以通过产生毒性NS1蛋白发挥作用[10]。

    用糖皮质激素诱导的启动子控制NS1基因在稳定转染细胞（SV40转化的新生儿肾细胞系NBE和c-Ha-ras癌基因转化的大鼠成纤维细胞系FREJ4）内的表达，研究MVMp（prototype strain of MVM）感染细胞后细胞周期的变化，发现NS1在细胞S期开始大量表达，干扰细胞DNA复制，细胞阻滞在S/G2期。NS1的表达还诱导了细胞染色质内缺口的形成[11]。由于细胞周期停顿是DNA损伤的一般表现，所以作者认为NS1是通过诱导细胞染色质的损伤而发挥增殖抑制作用的。但染色质缺口的形成到底是由NS1本身的内切酶活性引起的还是细胞内切酶活化引起的还不得而知。

    进一步的研究表明[12]，NS1介导的细胞周期阻滞与细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdk，Cyclin A/Cdk和Cyclin E/Cdk2复合物)抑制剂p21cip1的蓄积有关，而p21cip1的转录激活物p53却没有蓄积。用p53+/+和p53-/-细胞的实验表明p53对S和G2期阻滞都发挥作用, 而p21cip1-/-细胞的实验表明p21cip1仅对G2期阻滞发挥作用。这说明NS1诱导的p21cip1通过抑制cyclin A依赖的激酶活性使细胞停止在G2期。

    由于蛋白磷酸化在调控一些重要蛋白的活性，如转录因子和细胞周期调控蛋白等起重要作用，因此Anouja F等研究了NS1蛋白对宿主细胞蛋白的合成和磷酸化的影响。结果发现NS1干扰14kD、35kD、 50kD蛋白的磷酸化，提示NS1的毒性效应与细胞蛋白的磷酸化有关[13]。

    一些间接的实验证据表明细小病毒的抑瘤作用有免疫成分的参与[5]。例如，同时注射腹水细胞和MVMp的小鼠可产生长期的免疫力，对再次注射的肿瘤细胞产生免疫排斥现象，而小鼠本身没有MVMp慢性感染迹象，说明此免疫排斥不是体内病毒的作用。

    虽然免疫系统介导的抗瘤机制还不清楚，但可能的原因：一是感染病毒的细胞死亡后释放的病毒抗原被树突状细胞( DC )摄取，从而激发了抗病毒细胞毒性T淋巴细胞( CTL )介导的免疫反应，与肿瘤抗原产生了交叉反应；二是死亡的肿瘤细胞抗原被DC摄取，产生了抗肿瘤CTL反应；第三，病毒还可能通过干扰细胞因子网络，提高炎症反应和/或免疫反应而对抗肿瘤。

    支持以上可能性的实验证据是：在接受H-1 病毒感染后人肿瘤移植物消退的小鼠体内检测到活化的NK细胞浸润[14]。而且，用RV感染的大鼠体内一些具有免疫调节、抗肿瘤和抑制血管生成作用细胞因子表达增加。细胞因子表达谱的变化可能是病毒与肿瘤细胞和免疫细胞相互作用的直接或间接结果[5]。

    用H-1（MOI=20）感染黑色素瘤细胞SK29-MEL-1(HLA-A2+)和SK29-MEL-1.22(HLA-A2－)，培养6天，然后与正常血液分离的非成熟DC (iDC)共培养1天，对照为未处理的黑色素瘤细胞、冻融法处理（诱导坏死）的细胞和UV照射的细胞(诱导凋亡)。结果DC对H-1感染的和UV照射的肿瘤细胞裂解物(tumor cell lysates，TCLs )的吞噬能力强于冻融处理的细胞。iDC细胞与H-1感染的TCLs共培养后，出现CD80、CD83、CD86等活化DC标志。此外H-1感染的HLA-A2－的TCLs与DC共培养后，可使SK29特异性的CTL及A2+限制性CTL都释放IFN-γ，而坏死和凋亡的HLA-A2-TCLs没有特异性CTL反应，不释放IFN-γ。说明H-1诱导的TCLs可通过DC活化、提呈肿瘤特异性抗原(TAA)给肿瘤特异性CTLs，发挥抗肿瘤作用[15]。

    Raykov Z等[16]向生长B78黑色素瘤、MAIDS相关的淋巴瘤、H5V血管肉瘤的C57BL/6小鼠、正常B6小鼠腹腔及肿瘤内注射109PFU的MVMp病毒，1天后检测肿瘤、脑、胸腺、肺、肾、小肠、肝、脾、肿瘤引流淋巴结及远端淋巴结内病毒NS1转录物，腹腔注射各组没有大的差异，但瘤内注射组在肿瘤及其引流淋巴结内检测到病毒转录，血管肉瘤和黑色素瘤尤其明显，此后逐渐下降，2周后已检测不到。说明病毒可能在转移到淋巴结的肿瘤细胞或固有淋巴细胞内表达。进一步分析表达NS1的淋巴细胞亚群为CD11b(Mac1)+/CD11c+(MDC，髓样树突状细胞)或CD45B(B220)+(B1淋巴细胞)细胞，MDC和B1细胞IP-10表达显著升高，IFN-γ没有变化，但体外MVMp可显著提高LPS诱导的IFN-γ表达。IP-10是趋化因子，淋巴细胞的活化剂，因此间接的效应是激活其它免疫细胞并释放相应的细胞因子发挥作用。

    4   细小病毒H-1对肿瘤的易感性

    虽然H-1病毒的宿主广泛，但不同细胞对H-1的敏感性有差异。Cornelis JJ等[17]的研究表明，成纤维细胞和上皮细胞对H-1感染的敏感性是不同的，该作者比较了细胞中病毒mRNA的表达情况，结果表明敏感性的差异是与病毒结构和非结构蛋白的转录水平相关，而与病毒的摄入、基因产物在细胞内的定位、病毒mRNA的稳定性、非结构蛋白NS1的磷酸化都没有关系。H-1易感的角质细胞其中病毒DNA的复制扩增与H-1不敏感的细胞相比也没有变化。所以这几种细胞对H-1的易感性主要与病毒基因组的转录水平有关。

    Telerman A等从H-1敏感的人K562白血病细胞系分离到H-1抵抗株KS，发现KS细胞的恶性表型减弱，且抵抗H-1的杀伤[18]。细胞感染病毒1年以后，用PCR方法仍然能够在细胞内检测到病毒DNA，而且其培养上清感染指示细胞NBE，用H-1病毒DNA特异性探针杂交，也能检测到杂交信号，说明KS细胞释放了感染性病毒颗粒。分析KS及亲本K562细胞18种与分化有关的表面抗原，未发现不同。两者的生长倍增时间、细胞周期分析都相似。但两者的转化和致瘤能力明显不同，在软琼脂上的克隆形成能力KS比K562低10倍，克隆直径也小4倍，接种scid/scid小鼠，KS细胞在动物体内肿瘤出现晚、数量少，恶性表型明显减弱。从分子水平分析致瘤性的差异，发现KS细胞表达野生型p53。详细的研究证明p53功能和H-1抵抗密切相关，与细胞H-1受体丰度无关。

    5   细小病毒H-1的抗肿瘤作用机制

    关于H-1病毒抗肿瘤机制研究国内外已有一些报道，主要集中在病毒的细胞毒性、诱导凋亡、抑制增殖、诱导分化、增强肿瘤细胞免疫原性几方面。

    Rayet B[19]研究结果表明H-1可诱导急性单核细胞白血病细胞U937的细胞凋亡，其作用途径为：细小病毒感染可以导致caspase-3的活化，从而裂解多聚二磷酸腺苷—核糖聚合酶（PARP，caspase 的底物），引起的细胞形态学变化与TNF-α引起的凋亡相似。用表达毒性蛋白NS1、而病毒外膜基因被报告基因替换的重组H-1 病毒感染U937细胞也得到同样的结果。提示U937细胞的凋亡是病毒非结构毒性蛋白引起的。

    许多肿瘤细胞对凋亡诱导剂的反应性都与c-myc表达失调有关。凋亡诱导剂如TNF-α和FASL，可通过活化其相应的受体TNFR1和 Fas( Apo-1/CD95)而启动凋亡。U937细胞本身c-myc蛋白过度表达，c-myc能促进细胞增殖、抑制分化。当细胞感染H-1后，c-myc表达快速下调，TNF-α也能引起相同结果，与H-1感染的细胞增殖抑制作用一致。

    Lopez-Guerrero等[20]筛选出的4株对H-1病毒抵抗的U937细胞株(RU1-4)用细胞分化诱导剂处理时c-myc表达不下降, 同时RU1-4细胞经TNF-α诱导也不发生凋亡。可能是由于RU1-4产生了某些抗凋亡机制，比如c-myc表达不下调或某些凋亡抑制因子的活化。

    从有些方面来看诱导凋亡和抑制增殖是统一的，增殖与分化是相对独立的，诱导白血病细胞分化的同时也就抑制了其增殖，并且诱导其成熟，最终有利于诱导其启动凋亡机制对其杀灭。c-myc不仅在肿瘤细胞中高表达，在凋亡细胞中也是高表达。作为转录调控因子，一方面它能激活那些控制细胞增殖的基因，另一方面也激活促进细胞凋亡的基因，给细胞两种选择：增殖或凋亡。当生长因子存在，Bcl-2基因表达时，促进细胞增殖，反之细胞凋亡。研究发现有些抗白血病药物（如EGCG）可使HL-60细胞 c-myc基因的mRNA和蛋白水平均降低，而c-fos基因的mRNA和蛋白水平均升高，表明HL-60向成熟细胞的分化。所以要确定c-myc在H-1感染后的作用途径，还需做进一步的研究。

    Moehler M[21]研究了H-1感染对肿瘤细胞免疫原性的的影响，结果表明H-1感染可诱导黑色素瘤细胞SK29-Mel-1的凋亡，在病毒感染后肿瘤细胞MHC-1类分子和共刺激分子的表达不增加，而另一个免疫原性分子——诱导型热休克蛋白Hsp-72显著增加，甚至高于其他常规热休克处理。所以提示细小病毒的细胞杀伤作用可以在体内通过释放热休克蛋白Hsp-72来增强细胞的免疫原性，从而被机体免疫系统识别并杀伤。

    6   细小病毒H-1的致病性

    至今还没有发现H-1感染与人类疾病有关。尽管H-1感染可引起病毒血症和抗体产生，但没有任何症状。两项Ⅰ期临床研究证实，晚期广泛转移肿瘤病人感染H-1后，除了一过性病毒血症、抗体产生和肿瘤病变内病毒的复制外没有任何症状。流行病学调查结果表明，正常人群中H-1的感染率为5%（21/420），而肿瘤患者人群中的感染率仅为0.75%（3/414），明显低于正常人群，提示H-1感染有可能减少人类某些肿瘤的发生[22]。其机制可能为正常细胞尽管感染了病毒但不支持其复制，而肿瘤细胞能支持其完成整个复制过程，导致宿主细胞的裂解死亡[5]。

    Moehler M[23]用野生型和重组H-1病毒感染肝癌细胞系Hep3B、HepG2、Huh7和原代肝细胞，结果表明所有肝癌细胞均发生H-1诱导的细胞溶解，并呈剂量依赖性（MOI=0.2，2，20pfu/cell）。Hep3B和Huh7细胞比HepG2细胞敏感。细胞的死亡与H-1病毒DNA复制、NS蛋白表达有关，而且具有凋亡细胞的形态学特征。H-1病毒诱导的凋亡在p53基因缺失的Hep3B细胞和p53基因突变的Huh7细胞比表达野生型p53基因的HepG2细胞中更显著。Hep3B细胞的凋亡可以部分被caspase-3抑制剂DEVD-CHO抑制。而原代肝细胞在病毒感染5天后活细胞数、细胞形态、细胞释放AST，ALT，LDH等与对照无差异，NS蛋白表达为阴性。说明正常肝细胞在此实验条件下对H-1病毒感染不敏感（MOI=5pfu/cell），H-1病毒对正常肝细胞没有杀伤作用。

    作者还研究了H-1对免疫细胞的影响[21]，因为这些细胞有可能成为H-1病毒复制和发挥毒性的靶子，结果表明长期培养的淋巴细胞、单核细胞、成熟和非成熟树突状细胞对H-1 病毒均不敏感。MOI=20的H-1感染7天后，细胞活性、数量均与对照无差异，感染后3天细胞培养上清的LDH活性也无差异。FACS分析非成熟APC细胞和CTL细胞，H-1处理没有发生细胞凋亡。

    7   国内细小病毒H-1的研究进展

    国内关于细小病毒H-1的研究近10年来日渐深入，并取得了很好的结果。其中上海仁济医院消化病研究所做了大量卓有成效的研究工作：从体内和体外分析了H-1感染对细胞因子的影响，结果表明NS1基因转染胃癌细胞后IL-1α，β和IL-6核因子表达增加，推测H-1除对肿瘤细胞的直接杀伤外，还可通过增强细胞因子的表达发挥抗肿瘤作用[24]。在体内实验中， H-1感染猕猴后，动物血清IL-2、TNF和IFN变化都不大，反映出病毒感染早期机体免疫系统可能处于低激活状态，有利于建立一种稳定的细小病毒感染[25]。他们还研究了H-1感染胃癌细胞后MAPK信号转导途径中相关基因的表达，结果表明H-1抑制MAPK超家族特别是ERK1/2途径中的多个激酶和p38MAPK途径的核心激酶p38-γ的表达，减弱了它们对各种信号的传导功能，从而导致细胞生长紊乱，应激反应能力下降，细胞逐渐走向死亡[26]。近年他们又利用基因芯片技术，研究胃癌细胞被H-1感染后基因表达谱的变化，发现与信号转导、DNA合成及修复、细胞凋亡相关基因的表达明显改变，为深入阐明H-1抗肿瘤作用机制打下基础[27，28]。此外他们还建立了NS转基因小鼠模型，可进一步研究NS蛋白的功能[29]。

    中科院上海药物研究所张素胤等给裸小鼠皮下接种人胃腺癌移植瘤SGC-7901后，以2×107pfu/kg剂量在肿瘤周围注射H-1病毒，每周2次，连续3周，肿瘤抑制率达到58.5%。而腹腔注射的效果不明显[30]。

    复旦大学生命科学学院从上世纪90年代初就在国内开展了细小病毒H-1的研究，发现自发转化的人胎肝细胞HuL-1对H-1的敏感性大大增加，证实了H-1对转化细胞有选择性的抑制作用[31]。林万敏等所做的H-1安全性评估研究表明，H-1的致微生物回复突变试验、哺乳动物染色体畸变试验、啮齿类动物微核试验和过敏试验均为阴性，小鼠对H-1病毒的最大耐受剂量为5×1011pfu/kg，相当于设定的常用剂量的2 500倍[32]。但上海仁济医院消化病研究所的实验表明猕猴在静脉注射1×109pfu H-1病毒2个月后出现出血性胃炎和结肠炎[33]。因此，就PV H-1应用于临床而言，还有许多问题需要回答。

    由于肿瘤的发生发展是一个及其复杂的过程，任何针对单一因素和单一的治疗方法都不会根治肿瘤。而且细小病毒进入体内后能否发生其他的反应，还需作进一步的研究。但综合以上研究结果，可以看出自主细小病毒在治疗肿瘤方面具有一定潜力。德国癌症研究中心肿瘤病毒学研究所正在致力于制定H-1病毒的药物标准，并在脑胶质瘤的临床应用上取得了一定成果。因此可以期待H-1病毒将来会成为肿瘤综合治疗中的新成员。