胶质瘤的基因治疗

　　作者：祝源 ， 邹安琪    作者单位：南昌大学第一附属医院，江西 南昌 330006

　　【摘要】基因治疗被认为是一种很有发展前途的治疗途径，多种分子策略被用于胶质瘤的基因治疗。全文主要从胶质瘤基因治疗的抗肿瘤机制，不同载体系统的优势和缺陷，以及目前临床试验所取得的成果和存在的问题进行综述。

　　【关键词】基因疗法　载体　胶质瘤　RNA干扰

　　成人胶质瘤即使无远处转移，预后仍很差。外科手术切除后，恶性胶质瘤病人往往会在首次发病后1~2年内死亡[1]。胶质瘤具无限制增生，缺乏凋亡，富于血管，具有侵袭性等生物学特性，常规治疗方法如手术和放疗疗效很差，化疗药物毒副作用又很强。然而，近年来分子生物学的飞速发展促进了胶质瘤的基因治疗研究[2]。在动物模型或临床试验中，以下分子策略被用于基因治疗：引进前体药物激活系统，引进肿瘤抑制因子或细胞周期调节基因，引进生长抑制因子或它们受体的基因，引进血管形成抑制基因，激活免疫调节基因，引入溶瘤病毒，抑制基质金属蛋白酶，导入毒物和增强肿瘤对放疗和化疗的敏感性等[3]。

    1 抗肿瘤机制

    1.1 酶前体药物治疗

    酶前体药物治疗也称药物易感基因（drug susceptibility gene）治疗，或自杀基因（suicide gene）治疗。病毒、细菌和真菌中有一些酶类的基因，将它们转导至哺乳动物的细胞后，其表达产物将原先对细胞无毒或相对低毒的物质转变为细胞毒性物质，这种导致细胞“自杀”的基因称为“自杀基因”。目前研究最为广泛的是单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶（herpes simplex virus thymidine kinase，HSV-TK)基因转导的基因治疗[4]。

    HSV-TK基因能在哺乳动物中将无毒的核酸类似物——更昔洛韦（genciclovir，GCV）磷酸化成单磷酸衍生物，然后被细胞转化为三磷酸衍生物，从而成为细胞毒性药物。细胞分裂时这些已被磷酸化的GCV会被整合进DNA复制链中。由于这些核酸类似物可在DNA复制中作为终止子，所以就可以干扰靶细胞的DNA的合成，导致复制终止，细胞死亡[5]。体内试验证实，与对照组相比，鼠瘤体缩小了50%~80%。按照这种程序处理后，有一些动物体内的瘤体完全消失了[6]。GCV治疗后14天，组织反应表现为星形细胞增生和细胞凋亡，小胶质细胞增生和免疫反应起次要作用[7]，通过转基因或其他途径来激活小胶质细胞反应可以提高HSV-TK/GCV的治疗效果[8]。

    另外，酶前体药物治疗还有：①水痘—带状疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(VZVTK):可把无毒的6-甲基嘌呤阿拉伯糖转变为细胞毒性药物三磷酸6-甲基嘌呤阿拉伯糖；②大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)：可把无毒的氟胞嘧啶(5-Fc)转变为一种传统的化疗药物氟尿嘧啶(5-Fu)。

    酶前体药物治疗避免了全身应用常规化疗药物的毒副作用，同时可以尽可能多地使药物到达肿瘤靶器官,显示了治疗的优越性，目前已在胶质瘤的实验性治疗研究中获得了广泛应用。

    1.2 抗血管生成治疗

    抗血管生成因子(anti-angiogenic factors）对于像高级别胶质瘤这样的高度血管化的固体肿瘤，抑制血管生成被认为是一种很有希望的治疗途径。然而，长期、全身应用血管生成抑制剂会遇到许多药理学问题。针对抗血管生成基因，通过病毒介导基因转导往瘤体内输入抗血管生成因子是一个很有前途的治疗途径[9]。

    血管他丁（angiostatin）、内皮他丁（endostatin）和α1-干扰素（α1-IFN）：有研究者在体外把鼠（9L）和人（GL-15）胶质瘤细胞，移植到脑薄片上培养，观察和评价三个血管生成抑制因子对局部血管生成和发展的抑制作用。虽然三个基因都表现有血管抑制作用，IFN表现出最主要的抗血管作用。在体内，把基因修饰过的高级别胶质瘤移植到脑内，MRI和尸检发现，IFN引起大幅度的瘤体萎缩。这种抗肿瘤机制可能性最大是由这种主要的抗血管生成因子所引起，因为IFN 的表达引起显著的血管密度下降，同时伴随着广泛的瘤体坏死[10]。

    p16 基因：最近的研究显示进展性的恶性胶质瘤经常有p16的丢失。以复制缺陷腺病毒为载体，将野生型p16-cDNA与胶质瘤重组，其内皮生长因子的表达显著下降，猜测内皮生长因子可能是肿瘤血管形成的中枢调节因子。在体内，恢复p16 缺陷胶质瘤的野生型p16表达可以明显地抑制肿瘤的血管生成。另外，野生型p16对新生血管的抑制作用要强于转导野生型p53的抑制作用[11]。

    激活或增强肿瘤抑制因子或细胞分裂循环相关基因：与正常细胞相比，肿瘤细胞的生长和增殖能力明显增强，这种生长表型多基于抑癌基因的失活和（或）癌基因的过度激活。因此，可将具有正常功能的野生型抑癌基因通过各种途径转染到细胞中，重建失活的抑癌功能，恢复细胞的正常生长表型或诱导细胞凋亡，从而达到控制肿瘤细胞异常生长的目的。

    p53 基因：p53基因治疗在治疗多种肿瘤中都有临床进展。在大多数的胶质瘤中，虽然突变率只有将近30%，但p53基因都有功能异常。通过腺病毒转导人野生型p53，试图减慢肿瘤细胞的生长。一些学者证实，在治疗胶质瘤时，在多基因替代基因治疗的同时给以包含有p53的腺病毒可以产生附加效果[12]。

    Rb基因：高级别胶质瘤的进展中，几个抑癌基因不表达。在多数癌症中，包括30%恶性胶质瘤，都有视网膜母细胞瘤抑癌基因的异常[13]。发现Rb蛋白的失活是一个关键性的事件，并且提示在治疗这些肿瘤时，通过基因治疗恢复野生型Rb的活性可能有很大的用处。

    其他的凋亡相关基因：多个研究提示，其他的凋亡相关基因在对脑胶质瘤的基因治疗中有潜在的用途。这些凋亡相关基因包括：Fas/Fas ligand，caspase-8，p73-α Bax，Apaf-1，caspase-9，NF-κb caspase-3，gas-1，Bcl-2，and Bcl-X(L)[14，15]。

    1.3 癌基因反义治疗

    癌基因反义治疗也称靶向治疗技术。所谓反义就是与癌基因DNA或mRNA 特异互补的核酸，依据碱基互补原理,应用能与目的基因或其ｍRNA互补的核酸,通过空间阻遏作用，或诱导ＲNase-Ｈ的活性，或与目的DNA双股螺旋形成三聚体(triple helix)，抑制蛋白质合成，抑制癌基因的表达，抑制生长因子的分泌或封闭其受体,以期阻断癌细胞内的异常信号传导及自分泌和旁分泌环路,使癌细胞进入正常化轨道或引起癌细胞凋亡[16]。Li等[17]将放射线照射后DNA双链修复的70-Ku基因cDNA反向克隆到腺病毒载体中,在体外和体内感染小鼠肿瘤细胞，70-Ku反义RNA表达导致70-Ku蛋白的表达被抑制，不但提高了肿瘤细胞的放射敏感性，而且使肿瘤生长延迟。

    1.4 免疫基因治疗

    恶性胶质瘤的病理研究发现宿主对肿瘤的炎症反应很轻，从理论上有可能增强这种机体免疫反应，从而达到抗肿瘤目的。胶质瘤患者免疫功能缺陷这一事实为免疫刺激治疗提供了依据；再者胶质瘤细胞自分泌的某些蛋白因子可以抑制宿主免疫反应，降低或取消这种抑制作用同样可以成为治疗的目标。有以下两种途径。

    1.4.1 增强抗肿瘤免疫

    增强抗肿瘤免疫的基因治疗包括将具有免疫刺激作用的细胞因子基因如白细胞介素类(IL-2、IL-4、IL-6、IL-7)、干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF-α)[18]、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等直接注入肿瘤内或体外转导入TIL或LAK细胞,通过抗肿瘤活性物质的表达增强其杀瘤作用。已经证实，高级别胶质瘤产生像TGF-β免疫抑制因子，它们通过外周血效应细胞可以减轻抗肿瘤反应。这些免疫抑制作用可以被抗肿瘤反应中和[19]。

    1.4.2 增强肿瘤的免疫原性

    该途径是以经过放射的，经过免疫基因转导的自身同源肿瘤细胞疫苗为基础，用基因修饰过的肿瘤细胞来表达一定的细胞因子。这些疫苗治疗包括以下步骤：①培养胶质瘤病人手术切下来的胶质瘤细胞。②在体外，用包含有细胞因子基因的重组病毒感染胶质瘤细胞。③转导过的细胞再注给病人[20]。疫苗治疗诱导特异的细胞毒(性)T淋巴细胞活化，引起细胞介导细胞毒(性)反应，这提示了特异的抗肿瘤反应和潜在的全身免疫反应。这些免疫反应导致移植细胞和原发性脑肿瘤的衰减。再次给药鼠脑内肿瘤被治愈的试验也证实了疫苗治疗的保护性免疫作用，同样提示，对于高级别胶质瘤几乎普遍存在的复发问题该疗法可能很有前途，它可以有效地防止脑瘤的复发。

    多个细胞因子已经被研究，包括：IL-12，IL-6，IL-4，IL-18，IFN-γ，TGF-β，TNF-α，GM-CSF，B7-2， TNF-α，LIF 和 LT[18，21]。

    1.5 增强对射线或化疗的敏感性

    1.5.1 化疗增敏基因

    细胞周期调控因子WAF1/Cip1：研究显示，在胶质瘤中常有阴性WAF1/Cip1的高表达，并且WAF1/Cip1高度表达使得胶质瘤对化疗不敏感。有人正在研究是否下调WAF1/Cip1可以增强胶质瘤对化疗药物的敏感性。构建表达反义WAF1/Cip1的腺病毒，用于感染有内生性WAF1/Cip1高表达的D54胶质瘤。单纯下调WAF1/Cip1会导致细胞集聚并从培养皿上脱落。用顺铂和1，3-双氯乙烯—亚硝(基)脲治疗反义WAF1/Cip1感染过的细胞，锥虫蓝排除试验显示反义WAF1/Cip1感染过细胞明显死亡。这些结果显示减弱WAF1/Cip1的表达会导致细胞的死亡，同时可以增强胶质瘤对化疗药物：顺铂和1，3-双氯乙烯—亚硝(基)脲的敏感性，引起细胞凋亡。因此阻断WAF1/Cip1可能是一个有用的化疗增敏疗法[22]。

    胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶：5-氟胞嘧啶（5-Fc）被细菌胞嘧啶脱氨酶催化转化成毒性药物5-氟尿嘧啶（5-Fu）。从大肠杆菌把胞嘧啶脱氨酶基因克隆出来在人肿瘤细胞中表达可以使5-Fc转化成5-Fu。转染过的T1115胶质母细胞瘤比不表达的亲代细胞对5-Fc更敏感200倍，在7天内至少有90%的细胞被杀死。胞嘧啶脱氨酶表达的细胞可以杀死同一个培养瓶内不表达的细胞（旁观者效应）。高级别胶质瘤临床试验证明了前期在鼠身上的发现，这些再次证实了5-Fc基因治疗的潜在临床价值[22]。

    1.5.2 放疗增敏基因

    Bax基因：有种假说认为，转染有凋亡前基因Bax腺病毒可以加强对放疗抵抗的胶质瘤细胞对放疗的敏感性。体内试验显示，Bax腺病毒转基因治疗联合放疗可以增加胶质瘤细胞凋亡数，值得指出的是联合治疗导致鼠瘤体大幅度萎缩。治疗皮下注射肿瘤（D54MG），单纯用放疗，单纯用Bax腺病毒转基因治疗和两者联合治疗各自的凋亡率是12.3%、32.1%、78.5%。集落形成分析显示与对照组相比，试验组有双对数的抑制效果，但与其内生性p53 的水平无关[23]。这些结果证实Bax转基因腺病毒基因治疗和放疗有协同治疗作用。

    放疗增敏基因的启动子：对临床剂量电离辐射很敏感的合成基因的启动子已经被发展作为自杀基因的载体。一系列包含有不同增强子和启动子的质粒载体已经被构建。与电离辐射相关的基因有：CArG元件，包含有严格的DNA共有序列CC(A/T)(6)GG；对电离辐射非常敏感的Egr1基因（early growth response 1）。这些元件把他们的序列与合成基因启动子组合在一起，分析下游报道基因对电离辐射的表达。

    细胞受到电离辐射后这些特异转录控制元件和早期生长反应基因启动子活化，从而引起递增的基因表达。研究显示，CArG元件数量增加到一定水平就会激活辐射反应启动子，特异A/T序列的改变可以导致更为明显的阳性反应[24]。这些增强子可以被用来增强从载体到瘤体照射野自杀基因的表达。这些结果证实这种组合性的启动子对低剂量的电离辐射非常敏感，并且单独的CArG元件可以在它们正常序列之外作为电离辐射转录增强子。可以预见，后续对启动子的研究对放疗敏感载体的发展具有很重要的意义。

    p53基因：p53除了前述抑癌基因的功能外，它还可以增强肿瘤细胞对射线的敏感性。有研究证实，整合有人野生型p53基因的腺病毒可以减慢肿瘤细胞的生长[25]。RT2肿瘤细胞在转导前表达鼠天然野生型p53，然而在腺病毒转导后人p53高度表达。p53基因转导后进行2Gy~6Gy的放疗，发现RT2细胞存活细胞的减少，凋亡细胞数的增加。移植有p53转导RT2细胞的动物在接受放疗后其生存期明显长于对照组[25]。用腺病毒转导诱导p53的高表达，结果提示p53可以增强恶性胶质瘤对射线的敏感性，这些结果为p53基因治疗提供一个崭新的前景。p53病毒介导的基因治疗可能作为一个成功的治疗策略，不仅仅在人突变型p53表达胶质瘤有效，而且在表达野生型p53的胶质瘤上同样有用。

    细胞因子：一些细胞因子疫苗(GM-CSF，IL-4，IL-12)治疗不仅有对肿瘤接种免疫抑制作用，而且有放疗增敏效果。

    1.6 病毒溶瘤治疗

    在前体药物基因治疗中，复制缺陷病毒在肿瘤中的扩布是很有限的。为了解决这个难题，可以应用条件复制性病毒（例如病毒只能选择性地在肿瘤细胞中复制，而在周围脑组织不转染）。溶瘤病毒治疗策略中，病毒可以保留复制潜能，病毒复制导致宿主细胞死亡，同时其子代病毒颗粒可以感染和破坏周围的肿瘤细胞。溶瘤病毒在早期临床试验中表现出很好的前景[26~28]。溶瘤病毒治疗可能是基因治疗策略中最有希望的。

    1.7 联合基因治疗和RNA干扰

    多途径相结合的基因治疗是当今基因研究的趋势之一，包括以上两种或两种以上基因治疗联合使用，如化疗增敏治疗和基因免疫治疗联合，抑制血管的形成和免疫增强治疗联合等。1998年Fire首次观察到RNA干扰现象[29]。Fire在线虫中注入单链的顺式或反式RNA以及双链的RNA以比较其效果, 发现双链的RNA能够显著地降低基因的表达, 这一现象被定义为RNA干扰（RNA interference，RNAi) 。RNA干扰技术较传统的相似技术有更多的优点,很快在肿瘤研究和基因治疗中得到了广泛应用。胶质瘤同其它肿瘤一样是多基因相互作用和网络调控的结果,传统的技术诱发单一的基因阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长,而RNAi技术可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列特性,设计针对这一区段序列dsRNA分子,只导入一种dsRNA即可产生多基因同时剔除的效果。也可以构建含有多种dsRNA表达质粒而将多个序列不相关的基因同时剔除。体外试验已经证实针对EGFR的RNA干扰可以显著抑制胶质瘤EGFR的表达，阻止细胞生长，导致细胞死亡和抑制肿瘤浸润，为治疗恶性胶质瘤提供了一条新方法[30]。

    1.8 其他基因

    其他的作为备选的用于基因治疗的基因有：folylpolyglutamyl 合成酶基因，growth arrest-specific genes (gas1)，肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体基因 (TRAIL)，癌胚抗原基因，尿激酶型纤维蛋白溶酶原启动子基因，膜糖蛋白融合基因等[31~33]。

    2 载 体

    过去很多研究放在复制缺陷病毒上，但是它们有很多缺点。最近，人们把焦点集中在可复制病毒上，这些病毒可以保留复制潜能，有选择地复制，并通过癌细胞溶解破坏肿瘤细胞，而附近的神经元不受伤害。如前所述，溶瘤病毒在包括胶质瘤在内的固体肿瘤的治疗中显示出很好的应用前景，但是要在临床中实现其全面潜能，其疗效必须提高[34]。

    2.1 腺病毒

    胶质瘤虽然呈浸润性生长，但很少转移，所以局部瘤内注射是一个特别合适的策略。有两种办法被用于选择性复制的腺病毒：或用肿瘤特异性的启动子来调控病毒基因的表达，或去掉病毒周期循环中某个必须的功能[35]，因为胶质瘤周围的正常细胞是静止的，所以第二种策略对于脑肿瘤治疗来说具有特别的吸引力[36]。实验室研究显示，腺病毒胸腺嘧啶激酶基因治疗后有20% 的荷瘤鼠被治愈（生存期>6个月）[37]。试验显示，腺病毒比逆转录病毒在体内基因转导时效率更高[38]。然而，在肿瘤细胞的表达很少而正常上皮细胞的表达很高，这阻碍了腺病毒在肿瘤基因治疗中的应用。腺病毒的靶向技术似乎是一个很有前景的技术，这种技术可以有效地提高肿瘤细胞转导率，同时又可以有效地保护正常组织[39]。

    2.1.1 单链抗体靶向技术

    有些学者提出一种特殊的肿瘤靶向技术，这种技术用腺病毒受体和α-细胞黏附分子结合双去除的腺病毒为载体，用双特异的单链抗体靶向结合的人表皮生长因子受体或上皮细胞黏附分子。这些载体可以有效地选择其中一个在肿瘤细胞上结合受体。原发性胶质瘤培养时，双去除腺病毒的载体基因转导效率增加了123倍。另外，这些载体可以有选择的转导人脑肿瘤细胞而不是周围正常的脑组织细胞[40]。

    2.1.2 GFAP靶向技术

    为了限制对正常组织的毒性，构建一个重组的腺病毒载体，其中控制表达编码神经胶质酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein gene，GFAP) 的启动子启动HSV-TK基因[41]。在体内试验中，用GFAP靶向的腺病毒被注入裸小鼠C6瘤体内，接着进行GCV治疗，与对照组相比，实验组发现有明显的瘤体缩小[42]。

    2.1.3 乏氧肿瘤靶向技术

    当放疗和化疗效果都不好时，靶向肿瘤乏氧细胞的新疗法是非常有用的。乏氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF)介导对缺氧相关基因的转录，把乏氧敏感元件（hypoxia-responsive elements，HRE)与目的基因结合在一起。针对乏氧细胞，构建乏氧/ HIF依赖的复制腺病毒。试验显示，在缺氧时，乏氧细胞有乏氧相关的细胞表达和选择性细胞溶解死亡，但是含氧量正常的细胞正常[43]。

    2.2 单纯疱疹病毒-1

    单纯疱疹病毒-1 （herpes simplex virus-1，HSV-1)是最早被用于肿瘤基因治疗的重组载体。细胞培养和动物实验证实，HSV-1介导的基因转导是可行的，可以通过转基因生成毒物来杀死胶质瘤细胞。HSV-1载体之所以特别有用，因为它可以在遗传意义上被设计复制，并高选择性地在不同的肿瘤上分布，同时可以表达多种外源性基因。在体内，静脉注射像HSV-1这样的逆转录病毒存在着低感染率的难题，这可能是病毒被血清中补体介导的蛋白溶解灭活。如果病毒被直接注入瘤体，病毒可能不会被杀灭。

    最近，HSV-1 被用于溶瘤型细胞载体，而非复制缺陷载体。溶瘤型HSV-1被证实在鼠胶质瘤模型中有溶瘤效果而不损害正常组织，并在瘤体内有放大的基因传递作用，同时可以诱导特异的抗肿瘤免疫。现在，多种方法被用来提高溶瘤型HSV-1 的治疗效果，通过基因工程发展下一代载体，联合免疫基因治疗，联合常规治疗等[44]。

    2.3 其他病毒

    其他病毒包括：细小病毒、日本血凝病毒、塞姆利基森林病毒、麻疹病毒、EB病毒、新城鸡瘟病毒、腮腺炎病毒、水泡性口膜炎病毒、流感病毒、呼肠病毒、脊髓灰质炎病毒等，它们在体内和体外实验中被测试，用于基因治疗[45~47]，但是在胶质瘤的治疗中缺少进一步研究。

    3 临床试验

    针对恶性胶质瘤的标准基因治疗，即应用非复制的办法以病毒为载体转染瘤体细胞，在临床试验中并没有取得明显疗效，然而，溶瘤病毒在早期临床试验中表现出很好的前景[26~28]。

    先进的基因治疗临床治疗大多包括以下课题： 应用逆转录病毒或腺病毒来转染瘤体细胞的HSV-TK药物前体激活系统，腺病毒介导的p53基因转导，腺病毒介导的β-IFN基因转导， 疱疹病毒或腺病毒相关的溶瘤病毒治疗。其他的载体和基因仅处于细胞或动物试验阶段[48，49]。

    在成人复发胶质瘤病人中进行的多数临床Ⅰ/Ⅱ期试验的主要目的在于：评价其生物安全性，最大耐受剂量，以及细胞因子和疫苗的抗肿瘤效果；对有缺陷的塞姆利基森林病毒基因进行修饰后携带人类IL-2基因来转染瘤体细胞，评价其效果[50]。其他的临床Ⅰ/Ⅱ期临床试验显示了很好的安全性，并且由逆转录病毒介导的基因治疗显示了一定的有效性[51]。令人失望的是，在前瞻性的对照临床试验中，逆转录病毒介导的基因治疗并不能明显延长原发胶质瘤的总体生存期[52]。失败的原因可能是在体外能够观察到瘤体细胞基因转染率在病人身上并没有出现。

    据报道，在基因治疗成功地抑制同源性瘤体生长后3个月，发现瘤体局部有活动性炎症出现，浸润细胞有活化的巨噬细胞和星形胶质细胞，CD3+和CD8+淋巴细胞，以及继发的脱髓鞘改变。因此，未来在设计和评价治疗胶质瘤的临床试验时，不但要考虑肿瘤细胞死亡率，还要想到长期的炎症、髓鞘脱失和永久的转基因表达等的影响[53]。

    尽管基因治疗在细胞和动物试验中取得令人兴奋的疗效，但是临床试验的结果并不能令人满意。基因治疗距离真正的临床实际应用，仍有很长的一段路要走，存在着许多尚待解决的问题。人类基因组计划已经完成，随着研究的深入，将有更多基因的结构和功能被阐明，基因及其产物的改变在肿瘤发生发展中的准确作用将日渐明了；而进一步的试验研究必将使载体系统，给药方法及其表达调控更趋完善，这些都可能使基因治疗在21世纪成为胶质瘤治疗的一种常规手段。

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