细胞周期及其相关蛋白在食管上皮癌变中的表达及其意义
发表时间：2009-08-12 浏览次数：582次
作者：刘亮 王静 刘江惠 郭建文 左连富 作者单位：050011 石家庄，河北医科大学第四医院肿瘤研究所流式细胞室
【摘要】 目的 研究细胞周期调控因子细胞分裂周期素25A(cell division cycle 25 A,CDC25A )、转化生长因子²β（transforming growth factor²β, TGF²β）和Smad3蛋白在食管上皮癌变过程中的表达及其意义。方法 利用流式细胞术检测38例同个体的食管癌、食管正常黏膜组织的细胞周期以及CDC25A、TGF²β、Smad3蛋白的表达。结果 流式细胞术结果显示，食管癌与正常黏膜相比，增殖指数 (proliferation index,PI)显著增高（P<0.05），CDC25A蛋白显著增高（P<0.05），TGF²β、Smad3蛋白显著下降（P<0.05）。这些蛋白的表达量与年龄和性别无关（P>0.05），与组织学分级有关，低分化鳞癌与中高分化鳞癌相比，CDC25A蛋白显著增高（P<0.05），TGF²β、Smad3蛋白显著下降（P<0.05）。结论 CDC25A、TGF²β、Smad3的表达失衡与食管癌的发生有密切关系，可作为食管癌的诊断指标。
【关键词】 食管癌 流式细胞术 CDC25A TGF²β
0 引言 近年来的研究表明，肿瘤的发生从本质上是细胞增殖和凋亡之间失去平衡所致，即肿瘤细胞以无限增殖、分化受阻和细胞凋亡受抑制为特征。因此，目前抗肿瘤的研究热点集中在抑制增殖、诱导和调控肿瘤细胞凋亡方面。CDC25A对细胞从G1期向S期、G2期向M期过渡起着至关重要的作用， TGF²β、Smad3调控着CDC25A的表达。并有研究表明CDC25A在多种肿瘤中高表达[1]。为进一步明确食管上皮癌变的机制，为早期诊断和早期治疗提供理论基础，本实验采用流式细胞术检测不同病变食管组织的细胞周期和CDC25A、TGF²β、Smad3蛋白的表达，以探讨其在食管癌发生中的可能作用及临床病理意义。
1 资料与方法
1.1 临床资料 38例原发性食管癌（高中分化鳞癌26例、低分化鳞癌12例）和同个体手术切缘正常食管黏膜均来自河北医科大学第四医院2005年8月～2006年8月食管癌手术切除标本。患者术前未经任何治疗。所有标本由两位有经验病理医师进行病理组织学确诊。患者中男22例，女16例，年龄43～74岁，平均年龄57.48岁，中位年龄60岁。
1.2 主要试剂及仪器 鼠抗人CDC25A单克隆抗体 (克隆系：DCS²120)，美国 Santa Cruz公司产品；兔抗人SMAD3单克隆体 (克隆系：EP568 Y) ，美国Epit omics 公司；兔抗人TGF²β多克隆抗体（克隆系: SC²146），美国Santa Cruz公司；流式细胞仪，Epics²XLⅡ型美国Beckman Coulter公司。
1.3 流式细胞术检测组织细胞周期和CDC25A、TGF²β、Smad3蛋白 细胞周期的染色：网搓法制备单细胞悬液，取0.1ml(含1×106个细胞)，加入碘化丙啶（PI）1ml,在4℃冰箱染色30min，以500目铜网过滤，使样品成为合格的单细悬液，即可上机检测。 CDC25A、Smad3、TGF²β蛋白的荧光标记：取单细胞悬液0.1ml(含1×106个细胞)，分别加入1∶100稀释的CDC25A、Smad3和TGF²β抗体0.1ml，室温孵育30min，加入PBS 10ml洗涤一次，弃上清，加入FITC²IgG二抗工作液100μl，避光室温孵育30min，加入PBS 10ml离心同上，弃上清以除去未结合的荧光二抗，上机检测前加入PBS1.0ml，经500目铜网过滤后上机检测。在对免疫荧光标记物测定时，分别设PBS代替一抗和二抗的阴性对照，以及只加一抗或二抗的同型对照。
1.4 流式细胞术测量资料分析 CDC25A、Smad3、TGF²β蛋白表达定量分析，以实验样品蛋白表达的平均荧光强度(均道值)表示以上各蛋白的含量。
1.5 细胞增殖周期的计算 应用DNA细胞周期分析软件，计算出DNA组方图各时相分布的百分比，以增殖指数表示细胞的增殖活性，公式：
PI=S+G2MG0 /G1+S+G2M×100%
1.6 统计学方法 用SPSS11.5软件完成统计学处理，检测数据以±s表示，组间比较采用配对t检验，相关性分析采用Pearson检验，以α=0.05为检验水准，当P<0.05时表示差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 流式细胞术检测不同病变食管组织的细胞周期 食管癌组织与正常黏膜组织相比增殖指数PI显著增加(P<0.05)，见表1。
表1 不同病变食管组织中的增殖指数（略）
Tab 1 Proliferation index in various esophageal tissues
2.2 不同食管病变组织中CDC25A 、Smad3、TGF²β 蛋白表达量 食管癌组织与正常黏膜组织相比CDC25A蛋白表达显著增高（P＜0.05），Smad3和TGF²β表达显著降低（P<0.05），见表2。
表2 不同食管病变组织中CDC25A 、Smad3、TGF²β 蛋白表达量（略）
Tab 2 Expression of CDC25A,、Smad3 and TGF²β protein in various esophageal tissues
2.3 食管癌CDC25A、Smad3和TGF²β 蛋白表达与不同临床参数之间的关系 各蛋白表达量与年龄、性别无关，与组织学分级程度相关。低分化鳞癌与高中分化鳞癌相比，CDC25A表达显著增高（P<0.05），Smad3和TGF²β表达显著降低（P<0.05），见表3。
表3 食管鳞状细胞癌中CDC25A 、Smad3、TGF²β 蛋白的表达情况与不同临床参数之间的关系（略）
Tab 3 Expression of CDC25A,Smad3 and TGF²β protein and clinicopathologic features in esophageal squomous cell carcinoma
2.4 食管癌CDC25A、Smad3和TGF²β 蛋白表达的相关性 CDC25A与TGF²β、CDC25A与Smad3蛋白表达呈显著性负相关关系(P<0.05)，Smad3与TGF²β 蛋白表达呈显著性正相关关系(P<0.05)。
3 讨论 细胞周期紊乱及细胞周期调控因子分泌失衡是肿瘤细胞的典型特征。细胞分裂周期25（cell division cycle 25, CDC25）双特异磷酸酯酶是调控细胞周期的关键因子。目前人类细胞中已发现3种CDC25同型异构体，即CDC25A、CDC25B和CDC25C。其中CDC25A在多种肿瘤中如结肠癌、卵巢癌、乳腺癌等均有过度表达，并且与患者预后有关，因此，CDC25A被认为是一种癌基因。CDC25A的作用机制是当它被磷酸化后即具有磷酸酶作用，可将与CyclinA结合的CDK1的Thr14/Tyr15去磷酸化，激活CDK1，使细胞周期从G1期进入S期[2²3]。CDC25A过度表达可导致细胞生长失控后恶性转化[4]。人体内CDC25A的表达水平主要通过泛素依赖的蛋白酶体降解途径加以调控[5]。而TGF²β介导的信号转导可促进靶蛋白的泛素化，Smad3则是这一过程的限速因子[6²8]。最新的研究显示，多种肿瘤细胞系高表达CDC25A是由于泛素依赖的蛋白酶体降解途径的功能异常，同时伴有TGF²β/Smad3信号转导蛋白表达异常[9]，提示TGF²β/Smad3信号转导通路有可能通过调节泛素依赖的蛋白酶体降解途径而影响CDC25A的表达水平[10]。本实验的结果表明，细胞增殖指数食管癌组织高于正常黏膜组织。CDC25A在食管癌中的表达明显高于正常组织，而TGF²β、Smad3表达则低于正常组织，说明在食管癌的发生中存在CDC25A、TGF²β、Smad3的表达失衡，提示CDC25A、TGF²β、Smad3系统的平衡失调可能是食管癌变过程中细胞周期发生紊乱的重要机制之一。食管癌组织中TGF²β、Smad3的表达下调从而导致CDC25A降解量减少，导致细胞周期紊乱，增加细胞周期从G1期向S期过渡而使细胞呈现增殖旺盛的特征。 本实验结果还发现，CDC25A、TGF²β、Smad3表达量与食管癌的分化程度有关。低分化鳞癌与高中分化鳞癌相比，CDC25A表达显著增高，TGF²β、Smad3表达显著降低。提示CDC25A、TGF²β、Smad3表达失衡与食管癌的恶性程度相关，CDC25A表达越高，TGF²β、Smad3表达越低，食管癌的恶性程度越高。CDC25A表达越高，TGF²β、Smad3表达越低，会使组织细胞呈现增殖旺盛的状态，这与恶性组织细胞增殖特点相一致。 食管癌的发生可能有多条基因作用途径，目前研究推测，食管癌细胞可能通过下调TGF²β、Smad3的表达，而减少了对CDC25A表达的抑制，导致细胞周期发生紊乱，细胞产生失控性生长。
【参考文献】 ［1］ Hernandez S,Bessa X,Bea S,et al. Differential expression of cdc25 cell²cycle²activating phosphatases in human colorectal carcinoma[J].Lab Invest,2001,81(4):465²473.
[2] Broggini M,Buraggi G,Brenna A,et al. Cell cycle²related phosphatases CDC25A and B expression correlates with survival in ovarian cancer patients[J]. Anticancer Res,2000, 20(6C):4835²4840.
[3] Evans KL,et al.Overexpression of CDC25A associated with poor prognosis in breast cancer[J].Mol Med Today,2000, 6(12):459²465.
[4] Draetta G,Eckstein J.Cdc25 protein phosphatases in cell proliferation[J].Bioc Biop Acta,1997,1332(2):53²63.
[5] Bernardi R, Liebermann DA, Hoffman B. CDC25A stability is controlled by the ubiquitin²proteasome pathway during cell cycle progression and terminal differentiation[J]. Oncogene, 2000, 19(20): 2447²2454.
[6] Kretzschmar M,Massague J.SMADs Mediators and regulators of TGF²beta signaling[J].Curr Opin Genet Dev，1998,8(1):103²111.
[7] Fukuchi M, Nakajima M, Miyazaki T, et al. Lack of activated Smad2 in transforming growth factor²βsignaling is an unfavorable prognostic factor in patients with esophageal squamous cell carcinoma[J]. Journal of Surgical Oncology, 2006, 94(1): 51²56.
[8] Shi Y, Massague J. Mechanisms of TGF²beta signaling from cell membrane to the nucleus[J]. Cell, 2003, 113(6): 685²700.
[9] Han SU, Kim HT, Seong H,et al.Loss of the Smad3 expression increases susceptibility to tumorigenicity in human gastric cancer[J]. Oncogene, 2004, 231(5): 1021²1029.
[10] Ray D, Terao Y, Nimbalkar D, et al. Transforming growth factor β facilitates β²TrCP²mediated degradation of CDC25A in a Smad3²dependent manner[J]. Mol Cell Biol, 2005, 25(8): 3338²3347.
