受体介导的cmyc反义核酸抑制肝癌Bel7402细胞增殖的机制

作者:蒋建伟,张洹

   【摘要】  　　目的 探讨半乳糖受体介导的cmyc反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide，ASODN)抑制肝癌Bel7402细胞增殖的机制。 方法 cmyc ASODN与半乳糖(galactose,Gal)聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)相作用形成GalPEIASODN复合物，作用于人肝癌Bel7402细胞，通过流式细胞仪检测细胞周期、AnnexinVFITC 和碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）双染色、DNA电泳实验观察GalPEIASODN对Bel7402细胞的作用。结果 采用流式细胞仪检测细胞周期，细胞对照组、GalPEI对照组、ASODN对照组，细胞增殖指数分别为35.04%、33.95%、32.90%，GalPEIASODN组细胞增殖指数为23.65%，与细胞对照组相比，subG1期＋G0/G1期细胞总数从64.03%增加到76.74%，S期＋G2/M期的细胞从35.04%减少为23.65%，GalPEIASODN组细胞增殖指数下降11.39%，差异显著（P<0.01）。采用细胞凋亡检测试剂 AnnexinVFITC/ PI 双染检测细胞坏死情况，细胞对照组细胞凋亡率2.77%，坏死率3.06%，正常细胞率94.13%；ASODN对照组、GalPEI对照组细胞凋亡率均在4%以下，坏死率均在6.8%以下；GalPEIASODN组细胞凋亡率6.5%，坏死率15.9%，正常细胞率下降为76%。DNA电泳实验中，GalPEIASODN组未发现细胞凋亡的DNA梯形条带，相反出现了弥散条带。结论 半乳糖受体介导的cmyc反义核酸通过阻止细胞从G0/G1 期细胞向S 期的转变，诱导细胞坏死，达到抑制细胞Bel7402增殖的作用。

【关键词】  cmyc　反义核酸　肝癌　细胞坏死　细胞周期

　　 Mechanism of cmyc Antisense Oligodeoxynucleotide Mediated by Receptor on the Proliferative Inhibition of Bel7402 Cells

    JIANG Jianwei,ZHANG Yuan

    Institute of Hematology,Medical College,Jinan University,Guangzhou 510632,China

    Corrseponding Author:ZHANG YuanAbstract：Objective   To observe the mechanism of cmyc antisense oligodeoxynucleotide mediated by galactose receptor on the proliferative inhibition of hepatocarcinoma Bel7402 cells.Methods  cmyc ASODN mixed with Galactose(Gal) polyethyleneimine(PEI) reagent forming GalPEIASODN complex,then incubated with Bel7402 cells for 48h,using Propidium Iodide(PI) dying,AnnexinVFITC and PI double staining,DNA gel electrophoresis to detected the proliferative inhibition mechanism of GalPEIASODN on Bel7402 cells.Results  Cell cycle was determined by flow cytometry.In the control group,GalPEI group and ASODN group,cell proliferative index was found to be 35.04%,33.95%,32.90%,respectively.However,cell proliferative index for GalPEIASODN group was found to be 23.65%,decreased by 11.39% compared to the control group（P<0.01）.Necrotic cell percentage was determined using AnnexinVFITC/ PI double staining test.The results showed cell apoptotic rate of 2.77%,cell necrotic rate of 3.06% and the normal cell percentage was detected as 94.13% in the control group;cell apoptotic rate below 4%,cell necrotic rate below 6.8% were detected in both ASODN group and GalPEI group; cell apoptotic rate of 6.5%,cell necrotic rate of 15.9% and the normal cell percentage of 76% were determined in GalPEIASODN group.There was no DNA ladder morphology,on the contrary,there was DNA smear morphology using DNA gel electrophoresis in GalPEIASODN group.Conclusion  The mechanism by which GalPEIASODN inhibits cell proliferation maybe that it can restrain the change from G0/G1 period to S period in cell cycle and induces cell necrosis.

 Key words：cmyc; Antisense oligodeoxynucleotide; Hepatocellular carcinoma; Necrosis;  Apoptosis

　　cmyc 基因是人们发现较早的一种原癌基因，cmyc蛋白是一种具有DNA结合功能的转录因子，启动细胞增殖，抑制细胞分化，参与细胞凋亡。人类许多肿瘤可检测到cmyc基因的异常表达，如白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、肝癌、头颈部肿瘤、食管癌、胃癌、结肠癌等。在正常肝组织，cmyc基因低表达或不表达，在原发性肝癌的癌组织及癌周组织中，cmyc蛋白表达水平显著性升高；cmyc蛋白表达与肝癌的发生、发展密切相关，而且与肝癌的分期、预后有关[1,2]。cmyc 反义核酸能抑制人肝癌细胞生长[3]。

    单纯反义寡核苷酸(Antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)导入细胞的效率不高，而受体介导的反义核酸投递系统则具有高效、靶向的特点[4]。肝细胞表面具有脱唾液酸糖蛋白受体等5种专一性受体，能识别末端带有半乳糖残基的糖蛋白或人工合成的配体并与之结合，这种配体－受体的结合是非常高效的。前期实验采用半乳糖(Galactose,Gal)聚乙烯亚胺（polyethyleneimine,PEI）交联载体与cmyc ASODN形成GalPEIASODN复合物，构成以肝细胞膜半乳糖受体为靶向的反义核酸投递系统，作用于人肝癌Bel7402细胞，证明半乳糖受体介导的cmyc反义核酸对人肝癌Bel7402细胞具有靶向投递作用并能高效抑制该细胞的增殖[5]，本实验旨在探讨cmyc反义核酸抑制Bel7402细胞增殖的作用机制。

    1材料与方法

    1.1主要试剂及仪器

    半乳糖－聚乙烯亚胺(GalPEI) 转染试剂（法国Polyplus Transfection公司）。cmyc 反义核酸的合成：针对cmyc 基因核苷酸序列162～179设计反义寡脱氧核苷酸并进行全程硫代修饰，上海生物工程公司合成，设计序列如下：5′CTT CTC GAG GCA GGA GGG 3′，AnnexinVFITC /碘化丙锭（Propidium Iodide，PI） 细胞凋亡检测试剂盒（美国Bender Medsystems公司和北京宝塞生物技术公司）。CO2培养箱(德国Heraeus公司)，流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)，Quantimet 970凝胶图像分析仪（英国剑桥仪器公司）。

    1.2细胞培养

    Bel7402肝癌细胞由中山大学北校区生化教研室惠赠。细胞培养体系：RPMI1640培养液，含10%灭活小牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素，置37℃、5 % CO2培养箱中培养，隔3d传代，Bel7402细胞用0.25%胰蛋白酶消化传代。实验选用对数生长期、台盼兰拒染率>95%的Bel7402细胞。

    1.3GalPEIASODN复合物的制备

    cmyc ASODN用不含血清的RPMI1640液溶解，配150μmol/L溶液备用。 实验前用不含血清的RPMI1640液分别溶解GalPEI转染试剂和cmyc ASODN，混匀，并使两者氮磷比为5.0，得GalPEIASODN交联复合物。

    1.4流式细胞仪检测细胞周期

    取Bel7402 细胞，调浓度1.5×105 cells /ml，接种于24 孔板，设2 复孔，待细胞贴壁达40%～50%时加入药物，设4组：① 细胞对照组；② GalPEI对照组(加入GalPEI转染试剂5μl，同第④组)；③ ASODN 对照组(0.375μmol/L)；④ GalPEIASODN组(含ASODN 0.375μmol/L)。37℃、5 % CO2培养48h。消化收集细胞，乙醇固定，碘化丙锭染色，流式细胞术测定各组细胞周期，并计算细胞增殖指数(Proliferatory Index,PI)，每个样本随机分析10 000个细胞。细胞增殖指数[6]＝(S期细胞数+ G2/ M期细胞数) /总的细胞数×100 %。

    1.5AnnexinVFITC及碘化丙锭(PI)双染色测定

    取Bel7402 细胞，设4组：① 细胞对照组；② GalPEIASODN组（含cmyc ASODN 25nmol/L，50nmol/L，100nmol/L，150nmol/L，250nmol/L，375nmol/L）； ③ ASODN对照组（浓度同②组）；④ GalPEI对照组（加入GalPEI转染试剂0.33μl，0.67μl，1.34μl，2.0μl,3.34μl，5.0μl，与②组的加入量一致）。培养48h，消化收集细胞，PBS和binding buffer洗涤，离心AnnexinVFITC 和PI 双染色，流式细胞术测定凋亡和坏死细胞的百分率，每个样本随机分析10 000个细胞，实验重复3次。

  1.6DNA电泳检测

    调Bel7402细胞，设4组：① 细胞对照组；② GalPEI对照组（加入GalPEI转染试剂6.67μl，同第④组）； ③ ASODN 对照组（0.500μmol/L）；④ GalPEIASODN组（含ASODN 0.500μmol/L）。培养48h。消化收集细胞，提取DNA，1%的琼脂糖电泳，80V电泳1h，凝胶图像分析仪观察电泳结果，实验重复2次。

    1.7统计学处理  采用SPSS 10.0统计软件分析数据，采用Poisson分布检验比较差异的显著性。

    2结果

    2.1细胞周期检测结果

    流式细胞仪可检测出不同细胞周期的百分率，如M1、M2、M3、M4期分别对应于细胞的M1（SubG1）期，G0/G1期，S期，G2/M期。在流式细胞仪的散点图上，细胞对照组、GalPEI对照组、ASODN 对照组细胞形态均正常，细胞碎片和细胞粘连较少，而GalPEIASODN组的散点图上出现了较多的细胞碎片。从细胞周期分布来看，细胞对照组、GalPEI对照组、ASODN对照组，细胞增殖指数分别为35.04%、33.95%、32.90%；GalPEIASODN组细胞增殖指数为23.65%，与细胞对照组相比，S期和G2/M期细胞均不同程度地减少，subG1期＋G0/G1期细胞总数从64.03%增加到76.74%，S期＋G2/M期的细胞从35.04%减少为23.65%，经Poisson分布检验，差异显著（P<0.01）；细胞增殖指数下降11.39%，见表1。 表1  GalPEIASODN、ASODN、GalPEI组代表性细胞周期检测结果注：与细胞对照组比较，*P<0.01,**P<0.01

    2.2AnnexinVFITC及PI双染色测定

    在凋亡初期细胞膜是完好的，在细胞坏死的早期阶段，细胞膜的完整性就破坏了。胞膜磷脂酰丝氨酸去极性外翻是细胞凋亡的一个重要标志，磷脂酰丝氨酸外翻也可发生在细胞坏死过程中，两者差别是细胞膜是否完整。Annexin V可以特异性结合磷脂酰丝氨酸；碘化丙啶（PI）不能进入活细胞，但可以进入坏死细胞并与胞内DNA结合，故PI 染色可以判断膜的完整性。流式细胞仪双变量散点图上，左下象限显示活细胞群(AnnexinV  / PI  )，右下象限显示凋亡细胞群(AnnexinV + / PI  )，右上象限显示坏死细胞群(AnnexinV + / PI + )，左上象限显示非特异性染色细胞群(AnnexinV / PI +)。

    结果显示细胞对照组的凋亡率2.77%，坏死率3.06%，正常细胞94.13%。 ASODN对照组细胞凋亡率在4%以下，坏死率在6.2%以下；GalPEI对照组细胞凋亡率在3.5%以下，坏死率在6.8%以下。GalPEIASODN实验组细胞凋亡率为6.5%，坏死率为15.9%，正常细胞率下降为76%。与早期凋亡细胞相比，坏死细胞百分率的增加更为显著，见图1。

    2.3DNA电泳结果

    药物作用于Bel7402细胞48h，提取DNA，电泳检测，GalPEIASODN 组细胞未出现典型的DNA 梯形条带，相反出现DNA弥散条带；细胞对照组、GalPEI 对照组及ASODN 对照组均未出现DNA 梯形条带。

    3讨论

    GalPEIASODN组与细胞对照组相比，S期和G2/M期细胞均不同程度地减少；细胞增殖指数下降11.39%。采用AnnexinVFITC/ PI 双染法可检测早期凋亡细胞和坏死细胞，实验发现GalPEIASODN组的细胞凋亡率最高为6.5%，细胞坏死率最高为15.9%；ASODN对照组、GalPEI对照组的细胞凋亡率最高为4%，细胞坏死率最高为6.8%。实验提示，受体介导的cmyc反义核酸对肝癌Bel7402细胞的致凋亡作用不显著，但对肝癌细胞具有一定的致坏死作用。DNA电泳发现，DNA呈不规则断裂，出现弥散状（smear）条带，未发现细胞凋亡的典型DNA梯形条带（Ladder）。

    cmyc蛋白属于具有DNA结合域的转录因子，cmyc基因激活导致大量G0 期细胞提前进入细胞周期，推动G0/G1 期细胞向S 期转变。cmyc ASODN 抑制肝癌细胞的增殖，使S 期、G2/M 期细胞百分率均下降，细胞增殖指数下降，这是由于cmyc ASODN 抑制了cmyc的表达，阻断了G0/G1 期细胞向S 期的转变，实验结果与理论相一致。

  cmyc分子中具有促进细胞增殖和介导细胞凋亡的结构域，两域互相重叠，具有介导细胞增殖和诱导细胞凋亡的双重作用。当cmyc蛋白表达上升且血清生长因子存在时，细胞进入增殖状态；当缺乏血清生长因子时，cmyc蛋白高表达可导致细胞凋亡[1]。Supino等[7]、Casteele等[8]分别提出细胞转染cmyc反义核酸，可抑制细胞凋亡的产生。刘颖格等[9]提出cmyc 反义寡核苷酸抑制大鼠气道平滑肌增殖，但未发现平滑肌细胞凋亡。本实验通过AnnexinVFITC/ PI 试剂进行双参数检测，发现cmyc反义核酸通过诱导细胞坏死而抑制细胞增殖，DNA电泳实验进一步发现DNA的弥散状（smear）条带，与刘颖格报道相一致。

    本实验证明，半乳糖受体介导的cmyc反义核酸通过阻断肝癌bel7402细胞从G0/G1 期向S 期的转变，诱导细胞坏死，达到抑制Bel7402细胞增殖的作用。

【参考文献】  　　［1］ Hermeking H.The MYC oncogene as a cancer drug target[J].Curr Cancer Drug Targets,2003,3(3):163175.

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[9]刘颖格,戚好文,李焕章,等.cmyc 反义寡核苷酸抑制大鼠气道平滑肌增殖与细胞凋亡无关[J].第四军医大学学报,2003,24(1):47.