TNF-α抗肿瘤作用机制新进展

作者：古翠萍 综述 张沂平 审校    作者单位：1.浙江中医药大学，浙江 杭州 310053；2.浙江省肿瘤医院，浙江 杭州 310022

 【摘要】TNF-α通过TNFR诱导肿瘤细胞凋亡；促进免疫细胞增殖分化，产生抗肿瘤效应；影响肿瘤局部血管，提高肿瘤血管内皮细胞通透性，促血栓形成，抗肿瘤新生血管形成，产生抑瘤或杀瘤效应。

【关键词】  肿瘤坏死因子　免疫细胞　抗肿瘤作用

　　1975年，Carswell等发现经卡介苗注射或细菌内毒素感染的小鼠血清中含有一种可引起荷瘤动物的肿瘤组织出血坏死的物质，该物质对体外培养的多种肿瘤细胞株具有细胞毒作用，但对正常细胞无杀伤作用，并将这种物质命名为肿瘤坏死因子（tumour necrosis factor，TNF）。Lienard等用TNF-α进行隔离性肢体灌流法治疗肢体性软组织肿瘤和骨瘤，取得了轰动成果。20世纪90年代末在欧美重新确认了TNF-α抗肿瘤的重要地位，掀起了TNF-α在肿瘤研究和肿瘤治疗中的新篇章。TNF-α具有多种生物学活性，本文就其抗肿瘤作用机制作一综述。

    1   TNF结构

    天然的TNF是一种糖蛋白，以两种形式存在，即TNF-α和TNF-β。TNF-α由细菌脂多糖活化的单核—巨噬细胞产生，可引起肿瘤组织出血坏死，包括可溶性的TNF-α(sTNF-α)和膜相关的TNF-α(mTNF-α) 两种形式，是由三个相同的单体亚单位组成的致密三聚体，以三聚体的形式发挥作用，属于Ⅱ型膜蛋白（即N 端在胞內区，C 端向胞外区），保持C端的完整性对维持TNF-α的生物学活性是必需的。TNF-β由抗原或丝裂原刺激的淋巴细胞产生，具有肿瘤杀伤及免疫调节功能。

    2   TNF-α抗肿瘤作用机制

    2.1   与受体结合诱导肿瘤细胞凋亡

    TNF-α通过与靶细胞膜上肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor receptor，TNFR）结合，实现其细胞毒性、抗病毒、免疫调节等生物学功能。TNFR存在于多种正常细胞及肿瘤细胞表面，有TNFR1和TNFR2两种亚型，由于TNFR1胞内区含死亡结构域，在溶细胞活性上起主要作用。Lyu等[1]用scFv23/TNF免疫因子促使SKBR-3-LP（TNF天然耐药）细胞表面TNFR1过表达，可提高HER-2/neu过表达的SKBR-3-LP细胞对TNF的敏感性。当TNF-α三聚体与靶细胞膜上TNFR1的胞外区结合，TRADD(TNFR1 associated death domain protein)抑制蛋白被释放，TRADD与TNFR1死亡结构域结合，形成TNFR1/TRADD复合体，该复合体招募一系列相关蛋白，引发不同的下游信号通路，促使肿瘤细胞程序性凋亡。

    2.1.1   诱导经典和非经典Caspase依赖型细胞凋亡

    TNFR1/TRADD 复合体通过其死亡结构域和FADD（Fas associated death domain protein）的死亡结构域结合，将FADD招募到TNFR1/ TRADD复合体，FADD蛋白N端死亡效应结构域(DED)，可以激活Caspase-8（属于ICE/CED3半胱氨酸蛋白酶家族），从而激活Caspase-3，通过级联放大反应，引起DNA断裂和细胞凋亡形态学改变，诱导细胞凋亡。Chosa等[2]发现用TNF-α预处理HSG细胞，促使Fas受体表达增加，激活Caspase，促进HSG细胞凋亡。TNF-α可通过诱导凋亡启动子如凋亡前体蛋白Bid、Bax表达，激活Caspase-8，引起级联放大反应，从而诱导肿瘤细胞凋亡。同时TNF-α也可诱导非经典的Caspase依赖型细胞凋亡，即改变肿瘤细胞质中线粒体的通透性，释放细胞色素C，分泌ROS，通过调节凋亡和抗凋亡因子，诱导肿瘤细胞死亡。

    2.1.2   招募TRAF2激活NF-κB 和JNK信号通路

    当TNF结合TNFR1后，TRAF 2（TNFR associated factor 2）可以与TRADD的N端结合,被招募到TNFR1/TRADD复合体上，从而活化下游一系列蛋白激酶，激活NF-κB和JNK信号通路。NF-κB是核转录调节因子，最为常见的研究最多是p50/p65。静息时NF-κB与抑制性蛋白ⅠκB 家族结合(NIK)以非活性的形式存在于胞浆中，激活后入核内，特异性地识别结合DNA，发挥其转录调节因子功能，促进细胞增殖。但是，在NF-κB活化后期，ⅠκB激酶活性下调使新合成的ⅠκBα得以积累进入核内与NF-κB结合，使NF-κB从DNA上解离下来，促使NF-κB重新返回到细胞质中，从而确保NF-κB活化过程适时终止。ⅠκB高表达同时可促进Caspase-8和Caspase-3的分泌，衰减FLIP(S)（Caspase-8的抑制剂）表达，阻止NF-κB核移位，增强TNF-α诱导细胞凋亡。Chang等[3]研究表明TNF-α介导的JNK信号通路加速抗凋亡蛋白c-FLIP（Caspase-8的抑制剂）转归，抑制NF-κB抗凋亡作用，促进细胞对TNF-α的敏感性。

    JNK（c-Jun N-terminal kinase）属于MAPK（促分裂原活化蛋白激酶）家族。当TRAF2被招募到TNFR1/TRADD复合体上，通过Tyr185和Thr183自身磷酸化，激活MAPK（促分裂原活化蛋白激酶），从而激活JNK信号通路。ASK1是MAPKKK家族成员，静息状态下，ASK1和抑制蛋白Trx结合，Trx能清除活性氧自由基。当TNF-α刺激细胞后,细胞内产生ROS，ROS使得抑制蛋白Trx改变构象，ASK1从ASK1/Trx复合体脱离，在Thr-845自身磷酸化下ASK1被激活，从而激活MAPKK4 和MAPKK3，6，激活JNK，最终激活JNK信号通路。JNK活性状态的延伸物jBID（BID蛋白水解的片段），能诱导线粒体释放Smac，随后Smac能把Caspase-8的抑制因子C-IAP1 从TNF-R1复合体上释放，降低对Caspase-8抑制，从而促进细胞凋亡的发生。Chang研究表明TNF-α介导的JNK信号通路，可加速抗凋亡蛋白c-FLIP（Caspase-8的抑制剂）转归，依赖JNK-介导的磷酸化和E3泛素连接酶Itch，使c-FLIP发生特异性遍在蛋白化，诱导c-FLIP蛋白酶体降解，从而促进TNF-α诱导细胞凋亡的发生。Wang等[4]用抗TNF-α和FasL抗体可以降低pX（protien X）依赖性的JNK信号通路的激活，导致TNF-α诱导细胞凋亡能力下降约70%。

    2.1.3   招募RIP诱导细胞凋亡

    RIP是一个蛋白激酶，C端具有死亡结构域，属于Ser/Thr激酶家族，是TNFR1/TRADD复合物下游信号的组成部分，RIP被招募到TNFR1/TRADD复合体上，可以与含有死亡区域的接续分子RAIDD相联接，使Caspase-2聚集于RIP，通过级联放大反应，引起细胞程序性凋亡。Devin[5]以Rip(-/-)鼠成纤维细胞研究表明TNF-α激活MAPKs细胞外联结信号激酶(ERK)、p38、 JNK信号通路，RIP是必需的。Hur[6]提出RIP是ⅠκB激酶上游调控分子对于DNA损伤是必要的，同时RIP可以聚集神经酰胺。在TNF-α引起细胞程序性死亡之前细胞内神经酰胺水平渐增，如L929，NIH3T3细胞。TNF-α与TNFR作用早期，中性鞘磷脂酶(nSMase)水解神经鞘磷脂(SM)生成神经酰胺(CH)，CH可以激活蛋白激酶介导细胞凋亡。Sawada等[7]研究表明TNF-α通过激活nSMase和SMases，刺激神经酰胺形成，诱导人神经胶质瘤细胞（p53野生型）凋亡。

    2.2   增强宿主免疫功能

    在细胞免疫方面，TNF-α以一种细胞与细胞接触的方式发挥细胞免疫作用。TNF-α能诱导单核巨噬细胞系统的前体细胞分化，扩大单核—巨噬细胞对肿瘤细胞的ADCC效应；也可促进骨髓基质细胞产生CSF，特别是GM-CSF，可促使骨髓释放中性粒细胞，刺激细胞脱颗粒和分泌髓过氧化物酶，提高中性粒细胞的吞噬能力；TNF-α可促使某些细胞表达MHCⅠ类分子、细胞间黏附分子，协同IFN-γ诱导MHCⅡ类分子的表达，启动T细胞介导的细胞免疫，增强T细胞(尤其CTL)、NK细胞、淋巴因子激活性杀伤细胞(LAK)及肿瘤浸润淋巴细胞( TIL)的细胞毒活性。Ebert[8]最近研究发现表皮Vδ1(+)γδT细胞通过诱导大量TNF-α、IFN-γ和CCR8配体CCL1分泌，使其具有产生细胞内穿孔素，显示对黑色素瘤细胞很强的细胞毒活性。

    在体液免疫方面，TNF-α能诱导B淋巴细胞的增生和分化，产生肿瘤特异性抗体，从而产生抗体介导的体液免疫抗瘤效应；同时TNF-α能诱导B淋巴细胞分泌细胞因子激活巨噬细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞，并协同刺激T细胞增殖从而参与免疫调节。张梅等[9]带有骨髓瘤个体基因型DC疫苗诱导抗骨髓瘤效应体外研究，表明TNF-α促使DC前体细胞分化为成熟DC，带有Id（个体基因型）成熟DC可以促进自体T淋巴细胞增殖，激活未致敏T淋巴细胞成为肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞，诱导有效的抗肿瘤免疫效应。

    2．3   作用肿瘤血管内皮细胞，导致血管功能紊乱

    2.3.1   肿瘤血管的高渗透性

    肿瘤血管的高渗透性依赖于内皮细胞过度表达的mTNF-α和可溶性VEGF。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)介导体内血管内皮高渗透性的病理生理过程，必须依赖TNF-α的功能。mTNF-α可能具有选择性地增强VEGF上调血管渗透性的功能，而对其诱导血管生成的作用无影响，sTNF-α在体内通过细胞骨架重排和胞内通道建立，破坏肿瘤血管内皮细胞的屏障功能，导致肿瘤血管的高渗透性，使化疗药物能更好地到达肿瘤局部，提高化疗药物疗效，降低化疗药物的剂量及毒副反应。国内有学者报道TNF-α可以降低内皮细胞膜钙黏蛋白的表达和激活MAPK的活性，从而增加血管内皮细胞的通透性。Kuroda[10]研究发现，RGD-V29（TNF-α突变型）较野生型TNF-α可能具有更高的选择性破坏肿瘤脉管系统活性。Ohtani[11]研究发现CPA代谢产物4-HC，可以提高TNF-α诱导DNA断裂，激活Caspase-3，通过线粒体依赖途径，提高脉管上皮细胞对TNF-α诱导细胞凋亡的敏感性，从而提高肿瘤血管渗透性。Koss[12]研究发现TNF-α激活蛋白激酶C和p38，使ERM磷酸化，磷酸化ERM可调节与肺相关的微血管内皮细胞通透性。

    2.3.2   肿瘤血管血栓形成

    Owen等[13]发现TNF-α和PAF (platelet-activating factor)可适当诱导细胞表面组织蛋白酶G（cathepsin G），改变内皮和上皮细胞屏障，损伤血管外基质，促进血栓形成。Nishigaki[14]将Meth A肉瘤移植于小鼠体内，在移植后第7天开始静脉注射重组人TNF-α（rhTNF-α），发现在肿瘤组织新生的血管内生成了纤维蛋白样物质，该类物质的生成加强了体内促凝血系统的作用，加速血栓形成，导致循环障碍，影响肿瘤组织血供。Lang[15]研究发现TNF-α诱导肾小球膜细胞分泌组织因子（tissue factor，TF）可诱导血栓形成；同时还发现经TNF-α作用后，肿瘤细胞内初级及次级溶酶体数目增多，得出rhTNF-α在体内的抗瘤机制是选择性阻碍肿瘤组织新生的毛细血管血供，最后导致肿瘤细胞自溶、肿瘤出血性坏死、消退或消失。Lans[16]提出高剂量TNF-α可导致肿瘤出血性坏死，内皮单核细胞活化多肽-Ⅱ（EMAP-Ⅱ）表达既可以增加肿瘤细胞表面TNFR1表达，在活体内增加肿瘤对TNF-α敏感性；又可以上调组织因子mRNA水平，促血栓形成，影响肿瘤组织血供，认为高剂量TNF-α可导致肿瘤组织出血性坏死。

    2.3.3   抗新生血管生成作用

    TNF-α可以选择性地抑制肿瘤血管上皮细胞，具有抗血管生成活性。Patterson 等发现TNF-α可以阻断人内皮细胞VEGF诱导的DNA合成，也可以下调VEGF受体的表达，发挥抗血管生成活性。有研究表明TNF-α对不超过9天的新生血管组织抑制更强烈，联合其它药物能在分子水平上抑制整合素的活性，从而引发肿瘤血管内皮细胞的解体和凋亡。国外研究发现Tumstatin45-132-TNF（具有tumstatin45-132和TNF-α活性）可有效减弱HepG2肿瘤生长，缩小肿瘤尺寸，减少CD31阳性脉管系统，亦有资料表明TNF-α可以部分上调ADAMTS1、4，ADAMTS具有抗血管生成活性。

    3   TNF-α可以提高抗肿瘤药物的疗效

    Cao等[17]以多药耐药细胞株MCF-7/Adr为研究对象，发现TNF-α/DOX联合使用，可抑制MCF-7/Adr细胞核内的RelA/p65活性，降低细胞内抗凋亡基因mRNA水平，同时可抑制抗凋亡因子p21的活性，有效诱导Caspase-8分泌，从而提高MCF-7/Adr多药耐药细胞的细胞毒效应，因此提出TNF-α/DOX可作为一种新的有效的治疗肿瘤耐药策略。Wan[18]研究发现TNF-α通过NF-κB亚单位p65途径，诱导Upase基因表达，提高5′-FUDR对鼠类乳腺癌细胞EMT6细胞毒性。Ando等[19]以非小细胞肺癌亲代细胞系PC-9、吉非替尼获得性耐药细胞系PC-9/ZD-2001、PC-9/ZD-2001返祖细胞PC-9/ZD-2001-R为研究对象，发现PC-9/ZD-2001对TNF-α敏感性最强，可能机制是：EGFR表达水平下降、ⅠκB降解减少、凋亡抑制蛋白C-IAP1和C-IAP2不表达，得出TNF-α可能对一部分吉非替尼获得性耐药的NSCLC有效。Sacchi[20]研究发现低剂量NGR-TNF（TNF-α衍生物），可以定向传递至肿瘤脉管系统，通过不同机制增加顺铂、紫杉醇、吉西他滨抗肿瘤效果，而不增加毒性，具体机制不明，需进一步研究。周清华等[21]以注射用重组改构人肿瘤坏死因子联合化疗药物治疗非小细胞肺癌的多中心Ⅲ期临床试验研究结果表明，rmhTNF 联合化疗药物治疗人非小细胞肺癌的疗效显著优于单纯化疗，rmhTNF 能明显提高化疗药物的敏感性，改善晚期肺癌患者的生活质量，临床应用安全、有效、不良反应轻微，是一种治疗人非小细胞肺癌的新型基因工程药物。

    综上所述，TNF-α是迄今发现的抗肿瘤活性最强的细胞因子，对体内外多种肿瘤细胞具有明显的细胞毒作用。临床上联合使用TNF-α可以明显增强化疗药物的疗效，却不增加毒性，机制不甚明确。因此，研究TNF-α抗肿瘤作用机制具有十分重要意义。

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