丹参酮ⅡA对人胃腺癌细胞SG-7901增殖、凋亡的影响
发表时间：2009-06-24 浏览次数：563次
作者:周晓丽,宋政军,王旭艳
作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院消化内科，陕西西安 710068；西安医学院护理系，陕西西安 710021
【摘要】 目的 体外实验检测丹参酮ⅡA(TanⅡA)对SGC7901人胃腺癌细胞增殖、凋亡的影响，探讨其可能的作用机制。方法 体外常规培养SGC7901人胃腺癌细胞用于实验，经TanⅡA作用后，采用MTT比色法检测细胞增殖情况，电镜及流式细胞仪观察胃腺癌细胞凋亡及细胞周期分布。结果 TanⅡA对胃腺癌细胞的生长有明显的抑制作用，呈剂量依赖性，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)；TanⅡA作用后胃腺癌细胞表现为凋亡特征性的形态改变；TanⅡA可时间依赖性地诱导肿瘤细胞凋亡。结论 TanⅡA对体外培养的SGC7901人胃腺癌细胞的生长有明显的抑制作用和诱导凋亡的作用，其可能的机制为TanⅡA可将细胞阻滞于G0/G1期，使其不能进入S期。
【关键词】 丹参酮ⅡA；胃腺癌；凋亡
The effect of Tanshinone ⅡA on proliferation and apoptosis of human gastric adenocarcinoma cell line SGC7901
Zhou Xiaoli, Song Zhengjun, Wang Xuyan
(Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061; Department of Nursing, Xian Medical College, Xian 710021, China)
ABSTRACT: Objective To observe the effect of Tanshinone ⅡA on proliferation and apoptosis of human gastric adenocarcinoma cell line SGC7901 and its mechanism. Methods The human gastric adenocarcinoma cell line SGC7901was cultured in vitro and with Tanshinone ⅡA at various concentrations. Cytotoxicity was valuated by MTT assay, apoptosisrelated alterations in morphology were ascertained by transmission electron microscopy. The cell cycle distribution and the apoptotic rate were investigated by flow cytometry. SGC7901 cell apoptosis with nuclear chromatin concentration and fragmentation as well as cell shrinkage and the formation of apoptotic bodies were observed by TEM. Results The growth of SGC7901 cells was inhibited significantly in a dosedependent manner. Tanshinone ⅡA could induce the apoptosis in timedependent manner. Conclusion Tanshinone ⅡA has effect in inhibiting SGC7901 cells and inducing the apoptosis. The apoptotic rate and percentage of cells in G1 phase increased in the SGC7901 cells treated by Tanshinone ⅡA.
KEY WORDS: tanshinone ⅡA; gastric adenocarcinoma; apoptosis
胃癌(carcinoma of stomach)是人类最常见的恶性肿瘤，占全部恶性肿瘤的10.5%，严重危害着人们的健康和生命。因此，对该病的防治倍受关注。自1972年Kerr等首次提出细胞凋亡概念以来，学者们研究发现肿瘤的发生与细胞的过度增殖及细胞凋亡通路受到抑制有关[1]。因此，诱导肿瘤细胞凋亡已成为抗癌药物筛选的新靶点。研究发现，许多中药单体、复方或从中提取的有效成分都是通过诱导肿瘤细胞凋亡来发挥抗癌抑癌功效的。丹参酮ⅡA(TanshinoneⅡA, TanⅡA)是从活血化淤中药丹参根部提取的脂溶性有效成分，为一种樱红色针状结晶，含有醌型结构，易被氧化还原，可参与机体的多种生化反应而有多种生物活性。因此，具有抗菌[2]、降低血液黏稠度、扩张冠状动脉、抗血小板、清除氧自由基、抗脂质氧化及改善记忆力障碍等广泛的药理作用。近年来，TanⅡA的抗肿瘤活性也被陆续报道，但作用机制仍有待深入研究。在本研究中，我们拟采用不同浓度的TanⅡA体外干预SGC7901胃腺癌细胞，观察其对胃腺癌细胞增殖、凋亡的影响，为胃癌的临床治疗探索新的途径。 1 材料与方法
1.1 材料 TanⅡA购自中国药物制品检定所，为化学标准品，溶于二甲亚砜(DMSO)中4℃冷藏备用。RPMI1640培养液购自GIBCO公司；人胃腺癌细胞株(SGC7901)由西安交通大学医学院第一附属医院临床分子实验中心提供，37℃恒温，50%(体积分数)CO2密闭传代培养。
1.2 方法 TanⅡA溶解于DMSO。DMSO终浓度为0.02%(体积分数)。用细胞培养液将TanⅡA配制成0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0mg/L不同质量浓度的工作液，设0mg/L浓度为对照组。实验将根据MTT结果选取最佳作用浓度的TanIIA处理癌细胞。
1.2.1 MTT比色法检测SGC7901细胞的增殖 将SGC7901细胞用胰蛋白酶消化后，血细胞计数盘计数，用含10%(体积分数)小牛血清的1640培养液制备为2×105个/mL细胞悬液，接种于96孔细胞培养板内，每孔200μL，生长24h后，随即将其分为6个作用组，每组6复孔。分别加入终浓质量度为0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0mg/L的TanⅡA培养液,分别于作用24、48、72h后每孔加入新鲜配置的5g/L MTT储存液20μL，继续孵育4h后，弃去上清液，每孔再加入150μL DMSO溶解细胞内结晶，5-10min后，490nm酶标测定仪测定吸光度(A)值。抑制率=(对照孔A490-实验孔A490)/对照孔A490×100%。
1.2.2 透射电镜观察 收集处于对数生长期的SGC7901人胃腺癌细胞，接种于25mL培养瓶内，随机分为两组，分别加入0、10.0mg/L TanⅡA，每组各6瓶细胞。药物处理细胞72h后，用胰蛋白酶消化细胞，置于EP管中，2000r/min，离心10min，弃去上清，收集细胞。加入4℃预冷前固定液20g/L戊二醛固定2h，PBS液清洗，10g/L锇酸固定1-2h，梯度脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸铀和枸橼酸铅双染色，透射电子显微镜下观察并摄影。
1.2.3 流式细胞术检测细胞周期 取培养于25mL培养瓶中的生长良好的SGC7901细胞，分别加入不同浓度TanⅡA干预，使终浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0mg/L，设0mg/L浓度为对照组。待药物作用72h后收集细胞，在PI、Annexin V双染色法下行流式细胞仪检测凋亡率及10.0mg/L TanⅡA干预后细胞周期的分布。
1.3 统计学处理 所有实验数据输入计算机中，采用SPSS11.0 for windows软件包进行统计分析。实验结果计量资料均以均值±标准差(±s)表示；MTT 法中每份标本平行测定6孔，求其(±s)，进行方差分析、SNKq检验；流式细胞术所测得的细胞周期构成以中位数M表示，进行构成比的χ2检验。检验水准为0.05。
2 结果
2.1 SGC7901细胞的增殖情况 不同浓度的TanⅡA作用细胞后，细胞生长受到不同程度的抑制，这一抑制作用随TanⅡA浓度的变化而变化，显微镜下观察可见细胞形态发生了明显变化(图1、2)；组间两两比较均有显著性差异(P<0.01)，并且浓度与抑制率间呈现明显的依赖效应(表1)。
图1 48h后对照组(A)和5.0μg/mLTanⅡA作用组(B)SGC7901细胞的生长情况（略）
Fig.1 The cell growth of negative control (A) and treated with 5.0μg/mL TanⅡA (B) After 48 hours (×100)
图2 72h后对照组(A)和10.0μg/mLTanⅡA作用组(B)SGC7901细胞的生长情况（略）
Fig.2 The cell growth of negative control (A) and treated with 10.0μg/mL TanⅡA (B) After 72 hours (×100)
2.2 透射电镜下细胞形态的变化 对照组的胃腺癌细胞胞核较大，有凹陷，畸形核或分叶核，染色质均匀。给予10.0mg/L TanⅡA后，细胞体积缩小，表面出现粗大的突起，细胞器肿胀，核固缩，染色质边集于核膜下，形成新月形小体，核膜消失或突起，核质浓缩，发生碎裂，形成凋亡小体，呈早中期的凋亡表现的细胞数明显增多。在凋亡晚期，可见膜包裹的内含细胞器和细胞核碎片的凋亡小体。
2.3 细胞周期和细胞凋亡的情况 10.0mg/L TanⅡA干预后，对照组SGC7901细胞周期分布分别为G1期49.8%、S期42.7%、G2期7.5%；TanⅡA组SGC7901细胞周期分布分别为G1期59.1%、S期32.2%、G2期8.7%，TanⅡA组较对照组G1/G2期细胞数量增多，而S期细胞数量减少(图3)。FCM定量显示，10.0mg/L TanⅡA作用后0、24、48、72h的凋亡率分别为0.2%、9.87%、26.39%、55.36%，随时间的延长，凋亡细胞增多，72h的凋亡率达到最高值，随后逐渐下降，与对照组比较，48、72h处理组凋亡率增高有统计学意义(P<0.01，图4)。
表1 不同浓度、不同时间TanⅡA作用后的吸光度值及其抑制率（略）
Table 1 TanⅡA on cell inhibition ratio under different concentration and different time
*P<0.01 vs. 0mg/L TanⅡA group
图3 对照组(A)和实验组(B)细胞周期分布图（略）
Fig.3 The cell cycle of control group (A) and experimental group (B)
图4 流式细胞仪检测凋亡散点图(凋亡率分别为26.39%和55.36%)（略）
Fig.4 The apoptosis scatterplot detected by flow cytometry
A: apoptosis rate 26.39%, after 48h with 10.0mg/L TanⅡ; B: apoptosis rate 55.36% after 72h 10.0mg/L TanⅡA
3 讨论 人们已知肿瘤的发生不仅与细胞过度增殖、分化受阻这些因素有关，还与细胞凋亡通路受到抑制、细胞寿命延长有关。因此，诱导肿瘤细胞凋亡已成为抗癌药物筛选的新靶点。通过诱导剂使肿瘤细胞凋亡增加、增殖力减弱达到治疗的目的[3]。由于中药治疗肿瘤的毒副作用小，使得其在肿瘤治疗方面显示出越来越大的优势，在我国也形成了中药治疗肿瘤的一大特色。 袁淑兰等[4]在以往对TanⅡA抗肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞分化的研究基础上，进一步探讨了TanⅡA对HL60细胞诱导凋亡的作用及可能的机理。结果表明2mg/L TanⅡA作用HL60细胞5d即可诱导凋亡的发生，细胞出现典型的凋亡形态改变，DNA琼脂糖凝胶电泳出现明显的DNA梯状降解；随药物浓度增加，凋亡细胞数目也随之增加，DNA梯状降解也愈加明显。而在以往的实验中发现采用无毒剂量的TanⅡA(0.5mg/L)作用HL60细胞，在诱导肿瘤细胞分化成熟的同时伴有细胞凋亡的发生。故推测小剂量TanⅡA可诱导肿瘤细胞向良性分化，同时诱导凋亡或诱导分化最终走向凋亡；而高浓度TanⅡA对肿瘤细胞则具有诱导凋亡作用，这也是TanⅡA发挥抗肿瘤作用的机理之一。本研究发现，TanⅡA对体外培养的SGC7901人胃腺癌细胞的生长有明显的抑制作用，细胞出现凋亡的典型形态改变。 细胞周期是肿瘤研究的热点，肿瘤的过度增殖与细胞周期调控因子紊乱有关[56]。正常细胞具有一系列调节系统来感受细胞周期的进行。当细胞受到损害时，会在相应的阶段终止细胞周期。若损害能修复则重新进入细胞周期，若损害难以修复则进入不可逆的G0期或自主凋亡。这些监管细胞周期运行、负责当损害发生时使其停滞的分子调节机制称为细胞周期的关卡。有实验将丹参酮作用于人肝癌SMMC7721细胞观察到细胞生长明显受抑制，细胞被阻止于G0/G1期，S期细胞数量明显减少。在细胞周期中，G1末期向S期是否顺利过渡，意味着细胞是否由G1期进入S期，此时细胞内相关基因表达水平及时而有显著的变化，为下阶段DNA复制做好了准备。因此，这一转变对于推进癌细胞周期进程具有重要意义[7]。本研究通过FCM测定细胞周期显示，10mg/L TanⅡA干预后的SGC7901细胞周期较对照组G1/G2期细胞数量增多，而S期细胞数量减少，表示TanⅡA可将细胞阻滞于G0/G1期，使其不能进入S期，从而抑制DNA合成和细胞增殖。G1期阻滞可使细胞增殖周期延长，增殖减慢。
综上所述，TanⅡA对SGC7901人胃腺癌细胞的生长有明显抑制作用和凋亡诱导作用。这为TanⅡA作为抗肿瘤药物用于临床治疗提供了一定的实验依据。
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基金项目：陕西省科技攻关资助项目(No.2004K18GT)
