人卵巢癌细胞中IL18、ICE的基因及蛋白表达分析

作者：崔澄 郝淑维 李保红 胡建军 张爱霞 程建新 单保恩

作者单位：050081 石家庄 白求恩军医学院（崔澄，李保红，胡建军，张爱霞）； 050011 石家庄 河北医科大学第四医院（郝淑维，程建新，单保恩）

    【摘要】  　　目的 从基因转录及蛋白表达水平检测白细胞介素18（IL18）、白细胞介素1β转化酶（ICE）在人卵巢癌细胞株SKOV3和3AO中的表达。方法 分别采用RTPCR及免疫细胞化学染色法检测SKOV3和3AO中IL18、ICE的mRNA及蛋白表达。结果 SKOV3和3AO中IL18 mRNA及蛋白表达均阳性，其中SKOV3的mRNA表达量显著高于3AO（分别为0.32±0.09、0.17±0.04，P=0.009）；而ICE mRNA及蛋白表达均阴性。结论 人卵巢癌细胞株SKOV3和3AO在基因及蛋白水平表达IL-18，但缺如ICE表达的特点，可能与卵巢癌的发生发展有一定的关系。

【关键词】  人卵巢癌； SKOV3； 3AO； IL18； ICE

　　The Gene and Protein Expression of Interleukin 18 and Interleukin 1β Converting Enzyme in Human Ovarian Cancer Cells  CUI Cheng*，HAO Shuwei，LI Baohong，et al．*Bethune Military Medical College，Shijiazhuang  050081，China

    【Abstract】  Objective  To study the expressions of interleukin 18 (IL18) and interleukin 1β converting enzyme (ICE) in human ovarian cancer cell lines (SKOV3 and 3AO) from the levels of gene and protein. Methods  The levels of their mRNA and protein were determined by RTPCR and immunocytochemistry staining, respectively. Results  IL18 mRNA and protein were expressed positively in SKOV3 and 3AO, and its mRNA level in SKOV3 was higher than that in 3AO（0.32±0.09 VS. 0.17±0.04，P=0.009）. But ICE mRNA and protein were negative in both of them. Conclusion  Human ovarian cancer cell lines SKOV3 and 3AO had mRNA and protein expression of IL18 but no ICE. Perhaps, these have certain relationship with the occurrence and development of ovarian cancer.

    【Key words】  Human ovarian cancer； SKOV3； 3AO； IL18； ICE

    IL18是近年来发现的具有抗肿瘤作用的细胞因子，常以非活性前体方式存在，只有经白细胞介素1β转化酶（interleukin 1β converting enzyme, ICE）剪切后，才能发挥生物学活性［1-4］。已有研究证实，正常人体多种组织及细胞中有IL18及ICE表达，而某些肿瘤组织中ICE的表达降低或缺如［5］，但有关卵巢癌细胞IL18、ICE的表达与卵巢癌发病之间关系的研究目前尚鲜见报道。因此，本研究从基因转录及蛋白水平分析IL18、ICE在卵巢癌细胞株SKOV3和3AO中的表达情况，初步探讨其在卵巢癌发生发展中的作用。

    1  材料与方法

    1.1  细胞及主要试剂  人卵巢癌细胞株SKOV3、3AO（由河北医科大学第四医院科研中心提供）；胎牛血清（杭州四季青公司产品）；RPMI1640及胰蛋白酶（美国GIBCO公司产品）；兔抗人IL18、ICE抗体（购自武汉博士德公司）；通用型SP2001免疫组化及DAB显色试剂盒（购自北京中杉金桥公司）；Trizol试剂（美国GIBCO公司产品）；RTPCR试剂盒（购自华美生物工程公司）。

    1.2  引物设计与合成  βactin、IL18及ICE引物序列查自GeneBank，经Premier 5.0引物设计软件分析核对，由上海生工生物技术有限公司合成。

    IL-18（147 bp）

    P1：5'-AAGACCAGCCTGACCAAC-3'

  P2：5'-ACCACAACCTCTACCTCC-3'

    ICE（383 bp）

    P1：5'-CTCAGGCTCAGAAGGGAA-3'

    P2：5'-CTGGGACTTGCTCAGAGTGTTT-3'

    βactin(838 bp)

    P1：5'-ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG-3'

    P2：5'-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3'

    1.3  RTPCR法检测IL18、ICE mRNA表达  分别取对数生长期SKOV3及3AO细胞，Trizol试剂提取总RNA。RTPCR总反应体系（30 μl）为：RTPCR酶混合物2 μl，20×缓冲液1.5 μl，dNTP1.2 μl，MgCl2 2.0 μl，p1、p2各1 μl，总RNA 2 μg。混匀后于PCR扩增仪进行基因扩增，IL18及ICE的扩增参数为，37℃反转录50 min，94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s；35个循环后72℃延伸7 min。βactin的扩增参数为，37℃反转录60 min，94℃预变性10 min；94℃变性45 s，57℃退火45 s，72℃延伸45 s；35个循环后72℃延伸5 min。以IL18、ICE mRNA表达阳性细胞HL60作阳性对照，每组均n=3。

    将PCR产物加至1.5%琼脂糖凝胶进行电泳。电泳图像于凝胶图像分析软件系统（AlphaImager 2200, Alpha Innotech）获取各条带的A值。以βactin表达为内参照，计算IL18、ICE表达强度的相对系数RC=IL18或ICE条带A值/βactin条带A值。

    1.4  免疫细胞化学染色法检测IL18、ICE蛋白表达  分别将细胞浓度调整为2×108/L，接种于6孔培养板中。待细胞爬片生长良好时，取出玻片于冷甲醇中固定30 min，严格按照试剂盒说明书操作。以锯齿形路线取10个视野，胞浆或胞膜染成棕色或棕黄色为阳性。以着色细胞数占视野细胞总数的百分比划分为：无染色或＜25％者为阴性，≥25％者为阳性。

    1.5  统计学处理  采用SPSS 11.5统计软件进行处理。以RC表示的mRNA表达数据以（±s）表示，进行t检验；蛋白表达采用确切概率法。

    2  结果

    两株细胞的IL18 mRNA表达均阳性，其中SKOV3的表达量显著高于3AO（RC分别为0.32±0.09、0.17±0.04，P=0.009）；两株细胞的ICE mRNA表达均阴性（图1）。

    两株细胞的IL18蛋白表达均阳性，主要定位于胞膜和胞浆，且无显著性差异（P＞0.05）；两株细胞的ICE蛋白表达均阴性（图2，见封4）。

    3  讨论

    人IL18前体经ICE裂解后产生成熟形式，可通过诱生IFNγ、增强NK活性及Th1型免疫反应等，提高特异性及非特异性抗瘤免疫，并可诱导肿瘤细胞凋亡。IL18的产生具有多源性，体内多种细胞（如单核/巨噬细胞、NK、Th1细胞、皮肤角质细胞、B细胞等）均可产生。ICE除可诱导IL18前体降解产生功能蛋白外，还可介导细胞凋亡［1-4］。

    正常卵巢组织中可检测到IL18及ICE的表达。我们的试验结果显示，不同的人卵巢癌细胞株存在不同水平的IL18表达，但ICE基因和蛋白表达均缺如。提示，即使卵巢癌细胞存在一定量的IL18表达，但ICE表达的缺如仍可能通过导致功能性IL18的形成受阻、阻碍肿瘤细胞凋亡而有效介导恶性肿瘤的发生，这可能是卵巢癌发生发展的重要机制之一。故推测，若通过免疫基因治疗的方法，将IL18及ICE基因导入卵巢癌细胞，可能对抑制肿瘤生长，促进肿瘤消退有重要意义。

【参考文献】  1 Takahashi HK, Iwagaki H, Hamano R,et al.Effects of adenosine on adhesion molecule expression and cytokine production in human PBMC depend on the receptor subtype activated. Br J Pharmacol,2007,50(6):816822.

2 Dai S, Zhou X, Wang B,et al.Enhanced induction of dendritic cell maturation and HLAA*0201restricted CEAspecific CD8(+) CTL response by exosomes derived from IL18 genemodified CEApositive tumor cells. J Mol Med, 2006, 84(12): 1 0671 076.

3 Lian H, Jin N, Li X,et al.Induction of an effective antitumor immune response and tumor regression by combined administration of IL18 and Apoptin. Cancer Immunol Immunother, 2007, 56(2):181192.

4 Leng JH, Zhang LH, Yao HP,et al.Antitumor effects of interleukine18 genemodified hepatocyte cell line on implanted liver carcinoma. J Chin Med, 2003, 116(10): 1 4751 479.

5 谢庆祥，汪鸿，缪友仁，等. 膀胱癌中ICE表达及其与细胞凋亡的关系. 中国现代医学杂志, 2002, 12(1): 2122.