放射与抗VEGF抗体对人肝癌移植瘤生长的抑制作用

作者:郑青平,陈龙华,石玉生

 作者单位：510515 广州,南方医科大学附属南方医院放疗科　

    【摘要】  　　目的 观察放射与抗VEGF单抗对人肝癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用。方法 SMMC7721肝癌细胞种植于裸鼠后肢皮下,成瘤动物分为放射+抗体组、放射组、抗体组和对照组,单抗每次每只50μg隔日腹腔给药,共6次,放射剂量20Gy一次给予,测肿瘤直径并计算瘤体积。抗体给药结束后2周处死动物,称瘤重,免疫组化法测肿瘤微血管密度。结果 放射和抗VEGF单抗明显抑制肿瘤生长,减少肿瘤微血管密度,但两组之间差异无显著性。放射与抗VEGF单抗联合较单纯放射或抗体抑瘤作用显著,三组瘤重抑制率分别为89.2%、75.3%和65.9%,差异有显著性。结论 放射结合抗VEGF单抗显著抑制肝癌移植瘤生长,是肝癌综合治疗的有效途径。

【关键词】  肝肿瘤　放射疗法　抗VEGF单抗;裸鼠

　　The Inhibiting Effect of Radiation and AntiVEGF Monoclonal Antibody on the Growth of Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts

    ZHENG Qingping,CHEN Longhua,SHI Yusheng

    Department of Radiotherapy,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China Abstract：Objective   To investigate the inhibiting effects of combining radiotherapy(RT) with antivascular endothelial growth factor(VEGF) monoclonal antibody(mAb) therapy on the growth of human SMMC7721 hepatocellular carcinoma(HCC) xenografts in vivo.Methods  HCC cell line was implanted s.c.in mice.All the mice with xenografts were divided into four groups,RT plus mAb group,RT group,mAb group and control group.AntiVEGF mAb was injected i.p.on alternate days for a total of six injections at a dosage of 50μg each mouse each time.For radiation,single radiation doses 20Gy were given.Tumor diameters were measured and volume was calculated.Mice were sacrificed 2w after the sixth injection and intratumoral microvessel density(MVD) was determined with immunohistochemistry.Results  RT and antiVEGF mAb significantly reduced the growth of tumors and the MVD was significantly smaller than that in the control group.There was no significant difference between RT group and mAb group.The inhibitory effects in RT plus mAb group was more significant than that in RT group or mAb group,and the inhibitory ratio of tumor weight were 89.2%,75.3% and 65.9%,respectively.Conclusion  Combining antiVEGF mAb with radiotherapy has significantly inhibitory effects on the growth of HCC xenografts.The strategy is one of the approaches for hepatocellular carcinoma treatment.

    Key words：Hepatocellular carcinoma;Radiotherapy;AntiVEGF mAb;Nude mice

　　肝癌是放射不敏感肿瘤,而肝脏对放射线较敏感,常规放射治疗的疗效不满意[1]。肿瘤血管形成对肿瘤生长及转移起着关键性作用,血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)是肿瘤血管形成的关键因子,抗血管形成可抑制肿瘤生长。肝癌是富血管肿瘤,抗血管形成治疗能抑制肝癌裸鼠移植瘤生长[2]。本文结合放射与抗血管形成治疗,观察两者对肝癌移植瘤生长的协同抑制作用。

    1材料与方法

    1.1材料

    实验动物 BALB/cnu/nu小鼠22只,购自南方医科大学实验动物中心,5～6周龄,雄性,体重19.0～22.0g,SPF层流柜分笼饲养。SMMC7721人肝癌细胞株购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。抗VEGF单抗，克隆号26503.11购自Sigma公司。

  其他主要仪器和试剂：培养箱（37℃、5%CO2）,Varian 23EX医用直线加速器（美国）,RPMI1640细胞培养液（含10%胎牛血清、青链双抗各100u/mg、100μg/ml）、胰酶,免疫组化SABC法相关试剂购自武汉博士德公司。

    1.2方法

    细胞繁殖传代,取指数生长期细胞胰酶消化，2 000r/s离心2min,收集细胞用0.9%生理盐水悬浮,显微镜下计数细胞浓度,生理盐水定容至2×107/ml。

    参考文献方法[3],裸鼠于饲养环境适应1d后种植,取裸鼠右后肢大腿外侧皮下为种植点,1ml注射器抽取0.2ml细胞悬液（含4×106个细胞）注入种植点皮下。

    肿瘤种植后1周,形成明显皮下肿块,种瘤后10d肿块直径约5mm。有1只动物未成瘤,1只动物成瘤直径2mm,此2只动物舍去。其余20只动物按随机原则分为,放射+抗体组、放射组、抗体组和对照组,每组动物5只。用游标卡尺测量肿块长径a及横径b,隔日测量1次,体积公式V=a×b2/2。

    无菌PBS液溶解抗体至100μg/ml,种瘤后10d分组后腹腔注射给药,抗体量50μg/只,隔日1次,共6次,无抗体组同样途径给予等体积量PBS。第4次注射抗体后24h放射治疗,放疗机房紫外线消毒,受照动物四肢以细绳固定在小木板上,照射野大小3×3cm,源皮距100cm,6MeV电子线,剂量率4Gy/min,总剂量20Gy一次性给予。

    种瘤后34d处死动物,分离肿块周边皮肤及非肿瘤组织,天平称重,瘤重抑制率=（1实验组平均瘤重/对照组平均瘤重）×100%。

    1.3免疫组化微血管密度(MVD)测定

    肿瘤组织10%甲醛固定24h,脱水石蜡包埋,切片厚5μm,免疫组化SABC法:一抗为多克隆兔抗鼠CD34,工作液1∶100稀释。即用型SABC免疫组化试剂盒,具体操作按试剂盒说明进行,DAB染色,苏木素复染,树胶封片。选细胞染色密集区高倍镜(×200)计数染色细胞,每片计数5个野取平均值。

    1.4统计学处理

    SPSS10.0统计分析软件,应用重复测量数据方差分析和多个独立样本非参数检验法处理数据,Ｐ＜0.05为统计学差异有显著性。

    2结果

    2.1放射及抗VEGF抗体抑制肿瘤生长

    移植瘤成瘤率高95.5%（21/22）,分组时各组瘤体积无显著性差异。放射治疗前给予抗体4次,肿瘤生长减慢,但差异不显著。种瘤后20d放射+抗体组、放射组和抗体组肿瘤体积显著小于对照组,且放射+抗体组较单纯放射或单纯抗体组对肿瘤生长的抑制有显著差异,此显著性差异一直持续至动物处死,而单纯放射组与单纯抗体组之间差异不显著,见表1。表1放射和抗VEGF单抗对肿瘤生长的抑制作用与对照组比较:**P＜0.001,*P＜0.05;与放射+抗体组比较:#P＜0.052.2瘤重抑制率和MVD放射+抗体组对瘤重的抑制强于放射组或抗体组,且放射组平均瘤重低于抗体组。各处理组MVD低于对照组,放射+抗体组低于放射组或抗体组,放射组与抗体组之间差异无显著性,见表2。表2瘤重抑制率与微血管密度与对照组比较:*P＜0.001;与放射+抗体组比较:##P＜0.001，#P＜0.05;与抗体组比较:☆P＜0.05

　　3讨论

    肿瘤生长及转移与肿瘤血管形成密切相关,VEGF是肿瘤血管形成的主要活性因子。研究表明,抗VEGF抗体能抑制移植瘤生长,降低转移率[4,5]。肝癌肿瘤血管丰富,癌细胞表达VEGF,抗VEGF抗体或抗VEGF受体抗体均能抑制人肝癌裸鼠移植瘤生长,降低微血管密度 [2，6]。抗VEGF单抗能抑制SMMC7721人肝癌移植瘤生长和降低肿瘤微血管密度,说明人肝癌裸鼠移植瘤表达了VEGF,抗VEGF单抗通过阻滞肿瘤血管形成而抑制肿瘤生长。

    放射与抗血管形成剂联合治疗胶质瘤、胰腺癌的实验研究表明，两者联合取得了控制肿瘤的协同作用[5，7]。抗血管形成剂不但减少肿瘤血管数目,而且通过改造肿瘤血管功能,使肿瘤对放射线更敏感,发挥放射增敏效应,如Winkler等[8]发现,抗VEGF受体抗体能诱导肿瘤血管出现一个“血管正常化的窗口期”,窗口期内肿瘤血管与正常血管功能相似,肿瘤氧水平高,肿瘤细胞对放射线敏感,在窗口期内放射治疗才能起到协同抗肿瘤作用。“血管正常化窗口期”出现在抗体治疗1周左右,抗VEGF单抗是否也诱导了这样一个窗口期并不清楚,我们实验中在抗体治疗1周时给予放射,正是基于这样一个窗口期的启示。

   放射可诱导肿瘤细胞表达VEGF升高[9],促进血管形成;同时放射对肿瘤细胞有直接杀灭作用,并引起肿瘤血管内皮细胞凋亡增加,减少VEGF刺激的目的细胞,共同作用的结果导致血管密度降低。而抗VEGF抗体则是通过中和VEGF或抑制其表达来减少对血管内皮生长的刺激,从而降低血管密度。

    Kaliski等[10]发现,放射通过肿瘤内环境诱导了一种保护肿瘤的途径,使肿瘤抗拒放射。VEGF保护放射诱导的血管内皮细胞凋亡,而此作用可以被抗VEGF抗体阻滞,因而抗VEGF抗体强化了放射的细胞毒作用,提高肿瘤的放射敏感性[11],这是放射与抗VEGF抗体联合治疗肿瘤的理论依据。放射+抗VEGF单抗在抑制肝癌移植瘤生长和降低肿瘤血管密度上,较单纯放射或抗VEGF单抗效果显著,可作为一种新的肝癌综合治疗方法的理论参考之一。

【参考文献】  　　［1］ 殷蔚伯,谷铣之.肿瘤放射治疗学[M].第3版.北京:中国协和医科大学出版社,2002.783784.

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