丙型肝炎病毒NS4B对肝细胞cmyc和ras蛋白表达的影响

作者：陈霞李昌平，徐建玉，陈枫　

作者单位：1.646000 四川 泸州医学院附属医院消化内科；2.遂宁市人民医院消化内科；3.泸州医学院附属医院传染免疫实验室

 【摘要】  　　目的 研究丙型肝炎病毒非结构蛋白4B(NS 4B)对肝细胞内癌基因cmyc和ras蛋白表达的影响，从而探讨其在肝癌发生机制中的可能作用。方法 通过脂质体介导法，将空白载体PXCN2及丙型肝炎病毒NS4B重组质粒PCXN2NS4B引入Chang肝细胞内，并G418筛选作稳定传代，RTPCR法鉴定质粒成功转染入肝细胞内，免疫细胞化学方法观察细胞内cmyc和ras表达情况。结果 获得具有G418抗性的Chang肝细胞；空白对照组及空白载体组无cmyc表达，转染NS4B组cmyc表达率为(21.3±1.2)%，与空白对照组及空白载体组比较差异有显著性；空白对照组及空白载体组ras弱阳性表达，转染NS4B组ras呈阳性表达，与空白对照组及空白载体组比较差异有显著性。结论 丙型肝炎病毒NS4B可促进癌基因cmyc和ras表达，并可能在丙型肝炎病毒的致癌机制中起重要作用。

【关键词】  丙型肝炎病毒　非结构蛋白4B　cmyc;ras;G418

　　The Effect of HCV NS4B on Expressions of cmyc Protein and ras Protein in Hepatic Cells

    CHEN Xia1,LI Changping1,XU Jianyu2,CHEN Feng3

    1.Department of Digestive disease,Affiliated Hospital of Luzhou Medical College,Luzhou 646000,China; 2.Department of Digestive Disease,The Suining People's Hospital; 3.Department of Infectious disease, Affiliated Hospital of Luzhou Medical CollegeAbstract：Objective   To investigate the effect of hepatitis C virus nonstructural protein 4B(HCV NS4B)on cmyc and ras gene expressions in hepatic cells,and to study the possible role in the carcinogenesis of hepatoma.Methods  The experiment was divided into negative control、empty vector PCXN2 and PCXN2NS4B.The recombinant plasmid (PCXN2NS4B) and the empty vector were transfected into Chang liver cells with liposome.Screening was performed with G418.HCV NS4B mRNA was detected by reversetranscription PCR.The protein expressions of cmyc and ras were analyzed byimmunohistochemistry.Results  Stable expression of the recombinant plasmid was found in transfected Chang liver cells.No expression of cmyc gene was found in control group and group PCXN2.The expression of cmyc gene in group PCXN2NS4B was 21.3% 1.2%.The expressions of ras gene in control group and group PCXN2 were lower than that in PCXN2NS4B.Conclusion  HCV NS4B promote the expression of cmyc and ras gene,suggesting that HCV NS4B may contribute to the viral carcinogenesis.

    Key words：Hepatitis C virus; Nonstructural protein 4B;cmyc;ras;G418

　丙型肝炎为全球流行性传染性疾病，据估计全球丙型肝炎病毒（HCV）感染者超过1亿人。原发性肝癌（HCC）是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤，且发病率呈逐年上升趋势，HCV与HCC关系密切，但HCV致肝癌的机制至今仍未明了，HCV是一种RNA病毒，无逆转录酶活性，也不与宿主基因整合，并且其本身没有一个可知的癌基因。其致癌作用可能与细胞凋亡受抑，癌基因及抑癌基因的突变及表达量的异常，细胞信号传导异常等有关。cmyc和ras为重要的原癌基因，大量的研究发现，cmyc和ras在HCV相关肝癌中起重要作用。迄今为止，HCV NS4B的功能尚不明确，HCV NS4B是否可影响相关癌基因与抑癌基因的表达,国内外未有相关文献报道。本研究利用脂质体介导技术将外源性基因NS4B导入正常肝细胞内，并G418筛选稳定传代，将cmyc和ras作为检测指标，探讨HCV NS4B可能的致癌作用。

 1材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1细胞与质粒

    Chang肝细胞株，由四川大学华西医学中心王修杰教授惠赠;空白载体PCXN2及PCXN2NS4B质粒，李昌平教授构建并保存。

    1.1.2试剂

    培养基RPMI1640（Gibco公司），小牛血清（成都哈里生物公司），TritonX100,G418（上海Sangon公司），脂质体转染试剂Dosper(德国Roche公司)，Trizol  RNA提取试剂（Gibco美国）,RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit (MBI)，ras多克隆抗体（Neomarker公司），cmyc抗体（Boster公司），SP超敏试剂盒（福州迈新生物技术有限公司）。

    1.2方法

    1.2.1细胞培养

    用RPMI1640(含10%小牛血清)将Chang肝细胞培养于37℃,5%CO2孵箱中,每2～3d换液一次。

    1.2.2基因转染及筛选

    取对数生长期细胞,转染前一天消化以3×105/ml接种于6孔板中,置于37℃、5%CO2孵箱中培养,待细胞生长达70%融合,将肝细胞分为3组,空白对照组（未转染的Chang肝细胞）、空白载体组（PCXN2转染组），PCXN2NS4B转染组，每组设两个复孔，转染前以无血清培养基洗细胞3次，以1.5μg/6μg配制质粒/脂质体混合物，轻柔混合后室温下静置15min，将混合物逐滴加入相应各孔，空白对照组加入等体积无血清培养基，6h后更换转染培养基，加入完全培养基继续培养，24h后加入G418（1 000mg/L）筛选，待对照组细胞全部死亡后，G418 减量为200 mg/L维持筛选并传代培养。

    1.2.3RTPCR转染细胞鉴定

    细胞生长足量时，Trizol试剂分别提取PCXN2组及PCXN2NS4B组总RNA，逆转录合成cDNA，按试剂盒说明书建立反应体系，取RTPCR产物10μl行琼脂糖电泳（具体操作按说明书进行）。

    1.2.4免疫细胞化学方法检测cmyc及ras蛋白的表达

    将空白对照组、PCXN2组及PCXN2NS4B组细胞分别消化接种于经多聚赖氨酸处理的盖玻片上,置于37℃、5%CO2孵箱中培养24h,PBS洗细胞3次,10%中性甲醛固定细胞30min,0.3% TritonX100通透细胞30min,过氧化物酶阻断剂孵育10min,非免疫性动物血清中孵育10min,加一抗4℃冰箱过夜后,生物素标记的二抗中孵育10min,加SP复合物孵育10min,DAB显色,苏木素复染,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,显微镜下观察，照相。以PBS代替一抗作阴性对照。每组细胞各进行了10次独立性实验。

    1.3统计学处理

    数据用±s表示。比较采用单因素方差分析，以P<0.05差异有显著性，利用SPSS 10.0软件进行统计分析。

    2结果

    2.1细胞转染及筛选结果

    用G418对各实验组的细胞进行筛选，结果显示：G418 1000mg/L筛选48h后，细胞开始脱壁漂浮，第6d转染组细胞出现新分裂增殖的细胞，第10d形成新生细胞克隆，呈集落状，第15d对照组细胞全部死亡，G418减量为200mg/L维持筛选，继续培养传代。

    2.2RTPCR抗性转染细胞的鉴定

    提取细胞总RNA，RTPCR扩增，可见PCXN2组及PCXN2NS4B细胞有mRNA表达，表明外源基因导入Chang细胞后，有稳定表达，见图1。

    M:1200bp DNA Marker；1：NS4B PCR product（780bp）

    图1RTPCR 产物琼脂糖电泳图谱

    2.3免疫细胞化学方法检测cmyc和ras蛋白水平的变化

    以细胞质或核内棕黄色着色为阳性结果，不着色为阴性，细胞计数以低倍视野100个细胞，共5个视野的阳性细胞，取其均值为阳性细胞数作统计处理。cmyc蛋白在胞浆和胞核均有表达。空白对照组及空白载体组无cmyc表达，转染NS4B组cmyc表达率为(21.3±1.2)%，P<0.01，与空白对照组及空白载体组比较差异有显著性；ras蛋白主要在胞浆及核周表达。ras空白对照组表达率为(1.2±0.5)%,空白载体组表达率为(1.3±0.2)%，转染NS4B组ras表达率为(52.6±2.4)%,与前两组比较差异均有显著性，P<0.01。

 3讨论

    丙型肝炎病毒NS4B是疏水的27KD蛋白。目前相关研究认为NS4B是HCV复制复合体的一部分，并且NS4B可能在HCV致病机制中发挥重要作用。NS4A/4B的蛋白前体可显著影响宿主对HCV感染的免疫反应[1]。Kato等[2]发现NS4B可激活NFκB相关信号,而NFκB可对抗TNFα诱导的细胞凋亡，提示NS4B可能可诱导细胞内的生存信号。Florese等[3]报道了NS4A和NS4B在翻译水平至少可部分抑制细胞内蛋白合成如RNase L、p53，其抑制宿主细胞翻译的机制可能有助于HCV在宿主细胞的生存与感染。本实验通过G418筛选，得到了HCV NS4B在正常肝细胞的稳定表达系统，观察了其对细胞内蛋白cmyc和ras表达的影响。

    cmyc是myc癌基因家族中最重要的一员，编码一种细胞核内的DNA结合蛋白，myc与不同因素，分别具有调节细胞增殖、分化及凋亡的不同效应。Ray等［4］将编码Ｃ蛋白的cDNA与cmyc共转染猴COS细胞，发现C蛋白呈现剂量依赖性激活cmyc基因的启动子活性。也有其他一些研究发现HCV核心蛋白可诱导cmyc表达[4,5]。本实验发现在HCV NS4B转染的正常肝细胞中cmyc蛋白呈现高水平的表达，而空白对照组及空白载体组未检测到cmyc的表达，这提示NS4B可能诱导cmyc在蛋白水平的表达。myc过度表达可改变细胞内周期调控，使细胞易于转变为恶性表型，与其他基因协同发挥作用可促使细胞的“永生化”，加速细胞增殖，引发肿瘤。

    Park JS等[6]报道协同表达NS4B和Hras基因的NIHT3细胞显示接触抑制的丧失、形态学上改变及锚着非依赖性生长，提示HCV NS4B和Hras共同作用在HCV感染细胞的恶性转变中起重要作用。本实验同时观察了HCV NS4B对癌基因ras蛋白表达的影响。实验结果显示，转染了NS4B的肝细胞组ras蛋白表达率明显高于对照组，显示NS4B可促进ras蛋白的表达。ras癌基因家族的蛋白产物能通过和GTP或GDP的结合来调节细胞的生长和分化，其表达异常与肝癌细胞的增殖有关。

    在实验性肝癌模型中，发现肝变异细胞、增生性病变以及肝细胞癌中，均可检测到cmyc及ras的表达增加，且有随病变进展而增加的趋势，cmyc和ras可能具有协同作用，促进细胞增殖而形成肝癌[7]。本研究显示HCV NS4B可诱导或促进cmyc及ras蛋白的表达。因此，推测HCV NS4B有可能通过影响cmyc和ras蛋白的表达，在促进肝细胞增生和恶性转化中发挥重要作用。肝细胞的癌变是一个多因素参与的多阶段发展过程，HCV NS4B究竟只是在某个阶段，或者是全过程参与肝细胞转化仍不清楚，另外，其影响癌基因表达后的进一步作用机制仍有待进一步的研究。

【参考文献】  　　［1］ Konan KV,Giddings TH Jr,Ikeda M,et al.Nonstructural protein precursor NS4A/B from hepatitis C virus alters function and ultrastructure of host secretory apparatus[J].J Virol,2003,77(14):78437855.

［2］ Kato J,Kato N,Yoshida H,et al.Hepatitis C virus NS4A and NS4B proteins suppress translation in vivo［J］.Med Virol，2002,66(2):187199.

［3］ Florese RH,NaganoFujii M,Iwanaga Y,et al.Inhibition of protein synthesis by the nonstructural proteins NS4A and NS4B of hepatitis C virus[J].Virus Res,2002,90(12):119131.

［4］ Ray RB,Lagging ML,Mayer K,et al.Transcriptional regulation of cellular and viral promoters by the hepatitis C virus core protein[J].Virus Res,1995,37(3):209220.

［5］ Siavoshian S,Abraham J D,Kieny M P，et al.HCV core,NS3,NS5A and NS5B proteins modulate cell proliferation independently from p53 expression in hepatocarcinoma cell lines[J].Archives of Virology,2004,149(2): 323336.

［6］ Park JS,Yang JM,Min MK.Hepatitis C virus nonstructural protein NS4B transforms NIH3T3 cells in cooperation with the Haras oncogene[J].Biochem Biophys Res Commun,2000,267(2):581587.

［7］ 罗丹，刘启福，苏建家,等.化学诱发大鼠肝癌变过程中癌基因原位表达的动态观察[J].细胞与分子免疫学杂志,1998,14(2):107109.