水飞蓟宾对人膀胱癌细胞株5637增殖的抑制作用及其机制
发表时间：2009-06-24 浏览次数：597次
作者：孙羿 曾津 张栋 王新阳 朱国栋 祝广峰 程鹤鹏 贺大林
作者单位：西安交通大学医学院第一附属医院泌尿外科，陕西西安 710061
【摘要】 目的 研究水飞蓟宾(Silibinin, SB)在体外对人膀胱癌细胞株5637增殖的抑制作用及其相关机制。方法 采用MTT法观察不同浓度SB对人膀胱癌细胞株5637增殖的抑制作用；倒置显微镜下观察细胞形态变化；RTPCR检测凋亡抑制因子Survivin的mRNA表达变化。结果 MTT检测发现：随着SB浓度增加和作用时间延长，对人膀胱癌细胞株5637增殖的抑制作用增强，且各组间比较均有显著性差异(P<0.01)，并呈时间剂量依赖关系；倒置显微镜发现应用SB干预后，5637细胞体积缩小，变形，胞浆浓缩，核固缩深染；人膀胱癌细胞株5637中Survivin的mRNA表达随着SB浓度增加和时间延长相应下降。结论 SB可抑制人膀胱癌细胞株5637的增殖；并下调凋亡抑制因子Survivin的mRNA表达。
【关键词】 水飞蓟宾；癌；膀胱癌；增殖；survivin；人膀胱癌细胞株5637
Effect of silibinin on proliferation of human bladder cancer cell 5637 in vitro and related mechanism
Sun Yi, Zeng Jin, Zhang Dong, Wang Xinyang, Zhu Guodong, Zhu Guangfeng, Cheng Hepeng, He Dalin
(Department of Urology, the First Affiliated Hospital,Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)
ABSTRACT: Objective To determine the effects of silibinin on inhibiting the proliferation of 5637 cell in vitro and to investigate the related mechanism. Methods The cell growth activity was evaluated by MTT assay. Morphological changes were studied through the inverted phase contrast microscope. The expression of survivin(inhibitor of apoptosis protein) mRNA was determined by reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR). Results Silibinin treatment of 5637 cells resulted in a moderate to strong growth inhibition in both a dose and a timedependent manner. There were significant differences between these groups (P<0.01). These morphological changes of 5637 which were treated with silibinin: cells shrank and turned round, condensed cytoplasma and pycnosised nucleus were observed through the inverted phase contrast microscope. There was also significant difference in the positive expression of survivin mRNA between the 5637 cell treated by differentiated silibinin. Conclusion Silibinin could inhibit the growth of human bladder cancer 5637 cells and downregulate the expression of survivin.
KEY WORDS: silibinin; carcinoma; bladder cancer; proliferation; survivin; 5637 cell line
水飞蓟素(SM)是从菊科植物水飞蓟中提取的黄酮类化合物，其组份中水飞蓟宾(silibinin, SB)含量最多，生物活性也最强。已知SB具有抗自由基活性、抗脂质过氧化、抑制5脂氧合酶等多种作用。近几年来研究还发现SB对各种上皮源性的肿瘤如前列腺癌、结肠癌、膀胱癌、肺癌等均具有良好抑制作用，并且已进入治疗前列腺癌的I期临床试验，但关于SB对膀胱癌的作用，国内外研究甚少。本文将研究SB在体外对人膀胱癌细胞株5637的抗增殖作用及其相关机制。
1 材料与方法
1.1 细胞株 人膀胱癌细胞株5637购自美国ATCC细胞库。
1.2 主要试剂 水飞蓟宾SB(C25H22O10·H2O)为美国Sigma公司产品，相对分子质量500.23；RPMI1640培养液为GIBCO公司产品；胎牛血清为杭州四季清生物制品公司产品；四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)为美国Sigma公司产品；脱氧核苷三磷酸(dNTP)、RNA酶、聚合酶链反应(PCR)的相对分子质量标记(Marker)为日本TaKaRa 公司产品；PCR引物由上海生工公司合成。
SB的配制：SB由二甲基亚砜(DMSO)助溶，过滤除菌，试验时用RPMI1640培养液稀释。
1.3 细胞培养 细胞株培养在含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液(内含1g/L青霉素+链霉素)，并置于37℃，50mL/L CO2培养箱内备用。
1.4 MTT法检测SB对人膀胱癌细胞株5637增殖的抑制作用 取对数生长期的人膀胱癌细胞株5637细胞，调整细胞浓度为5×104个/mL，取200μL接种于96孔培养板中。实验组SB的终浓度分别为0、25、50、100、200、400μmol/L。每种浓度设6个平行孔，于37℃，50mL/L CO2培养箱内分别培养24、48、72、96h后倾去培养液，每孔加入MTT溶液(5g/L)20μL继续孵4h，每孔加入150μL DMSO，振荡10min。最后于酶标仪490nm处测定各孔吸光度(A)值，重复6次，求平均值。设空白组作为测吸光度调零用。 细胞增殖抑制率=[对照组A值实验组A值]/对照组A值×100%
1.5 分组及浓度、时间选择 设控制组(DMSO)、SB组。根据MTT结果，SB组选择0、50、100、200μmol/L。作用时间选择24、48、72h。
1.6 SB作用后5637细胞形态的改变 细胞分组、处理同1.5，倒置显微镜下观察培养细胞形态。
1.7 RTPCR检测Survivin的mRNA表达变化 Trizol一步法提取细胞总RNA，调整RNA为1mg/L。取2μg总RNA用MMLV逆转录酶逆转录，PCR扩增survivin，同时扩增βactin作为内参照。Survivin基因引物序列如下：上游引物(5′CTGCCTGGCAGCCCTTTCTCAA3′)，下游引物(5′AATAAACCCTGGAAGTGGTGCA3′)，产物长度为453bp。循环条件：预变性95℃ 5min，变性94℃ 1min，退火56℃ 1min，延伸72℃ 45s，循环35次，终延伸10min。PCR产物经20g/L琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下观察并拍照。
1.8 统计学处理 应用统计软件SPSS13.0进行统计学分析。数据以(±s)表示，采用单因素方差分析。以P<0.05为有显著性差异。
2 结果
2.1 SB对人膀胱癌细胞5637生长曲线的影响 处于对数生长期的人膀胱癌细胞株5637按照各组要求给予相应处理后，控制组(DMSO)和SB组中0μmol/L组的细胞分裂增殖旺盛，形态正常，生长状态良好，两组细胞生长无明显差异；SB干预各组均产生抑制作用，细胞分裂增殖在干预后24h开始出现差异，第48h 100、200、400μmol/L三组细胞增殖抑制作用明显，细胞数目减少(图1)。
图1 5637细胞在SB作用下5637细胞的生长曲线（略）
Fig.1 Growth curves in 5637 cell line after exposure to silibinin
2.2 SB对人膀胱癌细胞5637的生长抑制作用 不同浓度的SB对5637细胞均有抑制作用，药物浓度越大，抑制作用越强；作用时间越长，SB的抑制作用越明显，呈现时间剂量依赖关系(表1)。
2.3 SB作用后5637细胞形态的改变 倒置显微镜下可见DMSO组和SB 0μmol/L组细胞贴壁生长良好，细胞间连接紧密，轮廓清晰，胞体饱满透亮。SB组细胞不同程度连接松散，细胞变形扭曲，部分细胞发生皱缩、崩解，胞体折光性减弱，胞浆中有较多颗粒。随作用时间和SB浓度加大，细胞变形越严重(图2)，漂浮细胞增多。
表1 MTT 法检测SB对5637细胞增殖的抑制作用（略）
Table 1 The inhibitory effect of silibinin treatment on 5637 cell as assessed by MTT test
At the same time point, *P<0.05; **P<0.01 vs. the control group
图2 不同浓度SB与5637细胞作用24、48、72h后形态学改变（略）
Fig.2 The morphological changes of 5637 treated with silibinin (×100)
A: 50μmol/L(24h); B: 100μmol/L(24h); C: 200μmol/L(24h); D: 50μmol/L(48h); E: 100μmol/L(48h); F: 200μmol/L(48h);
G: 50μmol/L(72h); H: 100μmol/L(72h); I: 200μmol/L(72h)
2.4 RTPCR检测Survivin的mRNA表达变化 应用200μmol/L SB组5637细胞中Survivin基因的表达在药物作用24h后较其他组明显下降，在作用48h和72h后未检测到；应用100μmol/L SB组5637细胞中Survivin基因的表达在药物作用48h后较24h组明显下降，在72h后未检测到；应用50μmol/L SB组5637细胞中Survivin基因的表达在作用72h后较24h和48h组明显下降(图3)。
图3 逆转录聚合酶链反应检测5637细胞中Survivin的表达（略）
Fig.3 The expression of Survivin in 5637 cells detected by reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR)
M: 50bp DNA ladder marker; B: βactin; O: negative control; 1: 5637 cells treated with DMSO for 24h; 2、3、4、5: SB 0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L (24h); 6: DMSO(48h); 7、8、9、10: SB 0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L(48h); 11: DMSO(72h); 12、13、14、15: SB 0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L (72h)
3 讨论 膀胱癌作为我国泌尿系统发病率最高的恶性肿瘤[1]，其中70%-80%为浅表性膀胱癌。治疗浅表性膀胱癌主要采取膀胱部分切除和经尿道膀胱肿瘤电切术。但术后3-5年内复发率高达60%-90%，且绝大多数于术后1年内复发。所以浅表性膀胱肿瘤手术后一般都采用膀胱灌注疗法来预防肿瘤的复发和抑制肿瘤向恶性发展[2]。目前膀胱内灌注药物主要分为化疗药物和生物免疫制剂两大类。这些药物的作用机制不同，膀胱灌注的疗效也有一定差异，而且不同程度的存在着心脏毒性、骨髓抑制、化学性膀胱炎、过敏反应、膀胱激惹症、血尿等副作用[3]。鉴于以上原因，寻找更加有效、可靠、安全的药物仍是膀胱癌治疗方面探索的重点。 SM是从菊科植物水飞蓟中提取的类黄酮化合物。在其组分中SB含量最多，生物活性也最高。临床上SB 主要用于治疗一些中毒性肝脏疾病，近期发现其在酒精性肝病中也有良好疗效[4]。在毒性实验中，于动物和人体中均表明SB 具有极低的毒性及良好的耐受性。近年来，美国及欧洲已批准SM/SB做为食品抗氧化营养添加剂上市销售。同时，近几年来人们还发现SB具有抗肿瘤作用[57]。SB可能通过以下途径发挥抗肿瘤作用：影响肿瘤细胞生长周期；诱导肿瘤细胞凋亡；信号转导的干扰作用；与肽生长因子IGFs的相互作用；抑制肿瘤血管生长；与多种化疗药物协同抗肿瘤(增敏减毒及逆转MDR作用)。鉴于其极低的毒性及明确的预防治疗效果，SB已被批准进入前列腺癌的I期临床实验[8]。SB作为一种无毒的、没有副作用的、天然的化学物质，在肿瘤的治疗中有着引人注目的应用前景。随着对SB抗肿瘤作用研究的深入，我们可以更加有目的有针对性的进行肿瘤的治疗。 MTT法检测药物对肿瘤细胞的抑制作用具有简便、快速、灵敏度高、重复性好等优点，现已广泛应用于抗癌药物的临床前研究中[9]。本实验MTT法显示，SB在体外对人膀胱癌细胞株5637有明显抑制作用，且其抑制程度随SB浓度的增加和作用时间的延长而增强，呈现出时间－剂量依赖性关系。本实验形态学观察和细胞活力检测都表明：对5637细胞给予SB干预时，各组均产生抑制作用，尤其是在第48h 100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L三组细胞数目减少，具有治疗意义。 凋亡是基因调控的主动的程序化细胞死亡过程，受多方面因素的调节，凋亡与增殖之间正常平衡的丧失，将导致肿瘤的发生和发展。Survivin是凋亡抑制因子(IAP)基因家族中作用最强的成员之一[9]，它可直接抑制末端效应器Caspase3和Caspase7并干扰Caspase9的活性，阻止细胞凋亡[10]。而Survivin 基因在恶性肿瘤中的高表达与肿瘤的凋亡抗性以及化疗耐药密切相关。有研究者认为：在人膀胱移行细胞乳突刺瘤RT4细胞中，SB可以使Survivin蛋白及其mRNA的水平减少和降低，发挥抗肿瘤作用[7]。本实验结果显示，SB组均可引起Survivin 基因的下调，且随着药物剂量的增加和作用时间的延长，Survivin mRNA的表达水平相应降低。
研究表明，SB抗肿瘤的内在机制复杂，而通过抑制Survivin诱导凋亡可能只是其中的一个方面，其他更深入的具体机制还需要进一步研究。
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基金项目：教育部骨干教师基金资助(No.教技司[00]143号)
