结直肠散发性腺瘤模型建立的探讨

作者：张耀朋,吕愈敏,李 军,金 珠,韩亚晶,李传凤,顾 芳    作者单位：100083 北京大学第三医院消化科

 【摘要】  目的 通过改进传统的DMH结直肠癌肿瘤模型诱导方法，建立一个高效、稳定、实用的结直肠腺瘤模型，以用于散发性腺瘤生物学行为和分子生物学机制的研究。方法 选用SPF级SD雄性大鼠。诱导剂为1,2二甲基肼（DMH）和PPARγ受体拮抗剂（GW9662）。PPARγ受体激动剂为吡格列酮。试验分四组：阴性对照组、DMH组、DMH+GW9662组、DMH+GW9662＋吡格列酮组。共观察12周。试验结束取远端结直肠(全结直肠的1/2)用福尔马林4°C过夜固定，美蓝染色后实体显微镜下观察、计数息肉，并照相。全部息肉及微隆起粘膜进行组织学检查。结果 阴性对照组无腺瘤发生。DMH组发现1枚腺瘤，腺瘤诱导成功率为12.5％（1/8），荷瘤数为0.125（1/8）。DMH+GW9662组发现16枚腺瘤，诱导成功率为87.5％（7/8），荷瘤数为2.0(16/8)。DMH+GW9662＋吡格列酮组发现5枚腺瘤，诱导成功率为28.6％（2/7），荷瘤数为0.714（5/7）。结论 DMH联合应用GW9662可以在短期内成功诱导大鼠结直肠腺瘤。该模型较单纯DMH诱导的大鼠结肠癌和畸变隐窝灶模型更具实用价值。

【关键词】  腺瘤性息肉；1,2二甲肼；GW9662；吡格列酮；PPAR γ

 Establishment of Animal Model Sporadic Colorectal Adenoma

    ZHANG Yaopeng,LV Yumin,LI Jun,JIN Zhu,HAN Yajing,LI Chuanfeng,GU Fang

    Department of Digestive Disease,Peking University Third Hospital，Beijing 100083,China

    Corresponding Author: LV Yumin,Email: ddbbol@163.comAbstract：Objective   To build an economical,effective and stable new experimental animal model of sporadic colorectal adenoma based on traditional DMHinduced colorectal carcinoma model.The new animal model can be used to investigate the biological behavior and molecular mechanism of adenomas.Methods  Male SpragueDawley rats were chosen in this study.Carcinogenic agent was DMH.GW9662 was chosen as the antagonist of PPARγ.Agonist of PPARγ was pioglitazone.Thirtyseven rats were randomly grouped into four groups,named as negative control group,group DMH,group DMH + GW9662 and group DMH+GW9662+Pioglitazone.The experiment period was 12 weeks.At the end of experiment,all rats were sacrificed by euthanasia.Half of the distal colorectum was taken and immersed in formalin at 4 ℃ overnight,and then recorded the polyps by anatomic microscope when stained by methylene blue.Photos of polyps were taken with high resolution digital camera and reversal film.All polyps and some flatten risen mucosa were verified by histology.Results  There were no polyps found in negative control group.One adenoma was found in Group DMH.The incidence of adenoma was 12.5% (1/8),and the adenoma load was 0.125(1/8).In Group DMH+GW9662,16 adenomas were found in all 8 rats.The incidence of adenoma was 87.5% (7/8),and the adenoma load was 2.0(16/8).The incidence of adenoma and the adenoma load in Group DMH+GW9662+Pioglitazone were 28.6% (2/7),0.714(5/7) respectively.Conclusion  The combination of DMH and GW9662 can induce rat colorectal adenoma efficiently in a short experiment period.This animal model can be used in colorectal adenoma and precancerous lesions related researches and have more advantages compared with traditional DMH induced colorectal carcinoma model and ACF model.

    Key words：Adenomatous Polyps;1,2Dimethylhydrazine;GW9662;Pioglitazone;PPAR gamma

传统的结肠癌动物模型以啮齿类动物为主，常见诱导剂有1,2二甲基肼（DMH）及偶氮氧甲烷（AOM），这是研究人类结直肠癌的重要手段。但是也存在很多不足之处，如诱导时间长，仅反映癌的特征，不能用于癌前病变的研究。而畸变隐窝灶（ACF）作为早期肿瘤研究的模型，虽克服了时间问题，但也存在很多缺点，如评价指标主观性强，缺乏组织学证据等。

    过氧化物增殖物激活受体γ（PPARγ）是核激素受体超家族成员之一，在糖脂代谢中发挥着关键作用。目前很多研究证明PPARγ参与了肿瘤的发生、发展，其结肠癌肿瘤组织中的表达和分布都有显著异常，而且有阶段性变化。从正常组织到腺瘤、腺癌，PPARγ的表达逐渐增强，在腺瘤组织中PPARγ的分布也发生了异常。而且体外研究发现，选择性PPARγ受体拮抗剂GW9662能够阻断具有肿瘤预防作用的药物舒林酸的肿瘤细胞抑制作用，说明GW9662具有潜在的促进肿瘤形成的作用[12]。

    本研究拟通过联合应用肿瘤诱导剂DMH和具有潜在促进肿瘤形成作用的选择性PPARγ受体拮抗剂GW9662，建立一种经济、实用、稳定、高效、客观的腺瘤模型，弥补结肠癌模型和ACF模型的不足。

    1  材料与方法 

    1.1  动物及分组

    采用SPF级雄性SpragueDawley大鼠，大小为5～6周龄，体重约200 g，饲养环境为北京大学医学部动物中心SPF实验室，恒温、恒湿条件下喂养，每日光照时间为12 h，饲料、水均不受限制。动物购自北京维通利华实验动物技术有限公司，SPF级饲料及含药特殊饲料由北京科澳协力饲料有限公司提供和协作生产。

    将37只大鼠，随机分成4组，DMH组10只；GW9662组、阴性对照组、DMH+GW9662＋吡格列酮组各9只。

    1.2  药物及使用方法

    肿瘤诱导药物1,2二甲基肼（DMH）和特异性PPARγ受体拮抗剂GW9662，均购自Sigma（中国）公司，PPARγ受体激动剂吡格列酮由杭州中美华东制药有限公司惠赠。DMH的使用方法是首次诱导剂量为腹腔注射120mg/kg， 2周后皮下注射20mg/kg加强一次。GW9662在DMH首次给药2周后使用，首次剂量为静脉注射0.3mg/kg，然后每周静脉注射0.1mg/kg。吡格列酮作为PPARγ受体激动剂通过制成特殊饲料的方式给药，剂量为3.2mg/kg，在DMH首次给药2周后使用。试验设计共12周。

    1.3  结果处理

    试验终期过量水合氯醛处死动物，取远端的1/2结直肠用福尔马林4℃过夜固定。2％美蓝溶液染色后实体显微镜下观察息肉，记录数目和大小并照相，实体显微镜下取材，按照大鼠肠道组织处理方法，进行脱水、透明、石蜡包埋后备用。石蜡标本切片后进行常规HE染色后请病理学专家对所取息肉及部分平坦黏膜进行组织学检查，并对腺瘤进行分型、分级。

    1.4  统计学方法

    试验数据用SPSS 13.0软件进行统计分析。计量资料用±s表示。在分析体重营养指数时，组间进行单因素方差分析，若P<0.05则行LSD Post Hoc Tests组间分析。对腺瘤数目用Pearson ChiSquare Test进行组间分析，如P<0.05则用Fisher’s exact ChiSquare Test 进行组间分析。

    2  结果

    2.1  大鼠死亡情况

    试验终期，阴性组9只，无死亡，故全部纳入腺瘤形成统计分析和体重－营养指数分析。DMH组10只大鼠共有2只大鼠死亡，有8只SD大鼠纳入腺瘤形成统计分析，其中一只由于在模型诱导期颈部溃疡较大，愈合较慢，单独饲养后出现明显异常的体重下降，待溃疡愈合放回原组后体重开始逐渐增加，但在每周体重增加值和最终体重上与同组中其他大鼠相比相差很大，故不纳入体重－营养指数分析。DMH+GW9662组9只大鼠中死亡1只，纳入腺瘤形成统计分析和体重－营养指数分析的大鼠均为8只。DMH+GW9662+吡格列酮组9只大鼠死亡2只，纳入腺瘤形成统计分析和体重－营养指数分析的大鼠均为7只。分析死亡时间距试验开始日期分别为2、15、16、24、66天，死亡大鼠均表现为盲肠扩大，小肠扩张，少量腹腔积液，回肠局部坏死、变黑，而结肠大体无明显异常。

    2.2  体重营养指数分析

    统计学分析显示，四组间平均终末体重、平均体重增加值、营养指数的差异均有统计学意义。阴性对照组在终末体重、体重变化值、营养指数方面均高于余组，差异具有统计学意义。DMH组在营养指数方面与其他两组差异无统计学意义。说明DMH诱导肿瘤形成的过程中显著降低了试验动物的营养指数，而GW9662、吡格列酮两种药物对试验动物营养指数则没有统计学意义的影响,见表1。

    2.3  腺瘤形成

    形态及组织病理学证实，阴性对照组无腺瘤发生。DMH组有1枚腺瘤形成，大小约4.0mm，病理为管状腺瘤Ⅰ～Ⅱ级，息肉诱导成功率为12.5％（1/8），大鼠的荷瘤数（即平均每只大鼠肠道形成的肿瘤数量）为0.125（1/8）。DMH+GW9662组发现表1  各组大鼠体重变化和营养指标表

    16枚腺瘤。实体显微镜下可见13枚较大腺瘤，见图1a，最大者约6.0mm，最小者约0.3mm，平均大小约1.3mm。3枚为微隆起粘膜，后经组织学证实为息肉型微腺瘤，显微镜在所在切面上看仅由数个腺管构成，见图1b。16枚腺瘤的病理表现为管状腺瘤I级的有9枚，见图2a。Ⅰ～Ⅱ级的腺瘤有4枚，见图2b。 Ⅱ～Ⅲ级的腺瘤有4枚，见图2c。腺瘤诱导成功率为87.5％（7/8），大鼠荷瘤数为2.0(16/8)。DMH+GW9662+吡格列酮组发现5枚腺瘤，最大5.0mm，最小1.0mm，平均大小约2.7mm，均为管状腺瘤Ⅰ～Ⅱ级，腺瘤诱导成功率为28.6％（2/7），大鼠荷瘤数为0.71(5/7)。对腺瘤诱导成功率和荷瘤数分别进行Pearson ChiSquare Test和单因素方差分析，发现DMH+GW9662组在肿瘤诱导成功率和息肉总数上均大于其他三组，差异具有统计学意义，其他三组之间的差异无统计学意义，见表2、3。

    3  讨论 

    自1970年Druckrey H首次报道用1,2二甲基肼诱导啮齿类动物结肠癌模型以来，该模型已被广泛用于结直肠癌的发生、发展、转移的病理组织学 表2  腺瘤诱导效果表 *：compared with other three groups,P≤0.016和分子水平机制研究，以及肿瘤化学治疗和化学干预研究[3]。常用的诱导剂有DMH和AOM。尽管不同的研究使用的剂量、给药途径、诱导期及总的观察期有所不同，但总体来说有以下特点：(1)有关结直肠肿瘤的模型多是以腺癌为主，腺瘤仅占10％～30％；（2）平均荷瘤数为1.08～1.95，（3）动物发生肿瘤的成功率为70％～90％，（4）模型诱导时间在27周～40周不等。

    Rubio C等[4]在一次关于扁平腺瘤－腺癌序列模型研究中使用了300只SD大鼠，DMH诱导，观察27周，其中278只（92.7％）大鼠产生肿瘤，共形成腺瘤或腺癌358个，平均每只大鼠荷瘤量为1.19，而这些肿瘤中腺瘤仅有60枚（16.76％），腺瘤荷瘤量仅0.2。Medina V等[5]进行了一项为期8个月研究，阳性组中肿瘤发生率为94.7％（18/19），肿瘤个数为37枚，每只大鼠荷瘤数为1.95，但其中只有1枚腺瘤。2000年，Ravnik G等[6]使用150只Wista大鼠，DMH诱导15次，形成45个肿瘤，其中腺癌为24个、印戒细胞癌为14、腺瘤为7个，每只大鼠的平均荷瘤数0.3，腺瘤荷瘤数仅为0.05。Goeting NLM等[7]人进行的一项关于华法令癌前病变早期干预作用的研究中使用了AOM，观察40周，结果阳性对照组25大鼠中发现27处肿瘤，每只大鼠荷瘤量为1.08。Kobaek L等[8]在观察3种近交系大鼠BDIX/Orllco、F344/NHsd、WAG/Rij对AOM（15mg/kg wk）诱导肠道肿瘤的反应情况，发现肿瘤发生率最高、周期最短的种系是BDIX近交系大鼠，但其肿瘤产生的时间仍要23～27周，肿瘤发生率仅75％。Melen M等[9]在研究DMH对大鼠肠粘膜增生、凋亡试验中，历时21周，共发现肿瘤37例，其中27例为腺癌，1例印戒细胞癌，9例腺瘤。Hirose M等［10］采用DMH 40mg/kg皮下注射诱导F334大鼠肿瘤以观察绿茶提取物的抗癌作用，历时36周，其阳性组肿瘤发生率为81％（17/21），产生腺瘤的大鼠有9只，腺癌有14只，平均每只大鼠荷瘤数1.8，腺瘤荷瘤数仅0.7。

    随着早期结直肠癌及其癌前病变研究的进展，尤其是药物在结直肠癌早期化学干预治疗中作用的研究逐渐成为研究热点，如NSAIDs、绿茶提取物、大蒜提取物等。此时传统结肠癌模型的弊端更加明显，无法满足研究需要。

    自1987年，Ranjana Bird等[11]首次报道了AOM诱导的大鼠畸变隐窝灶（Aberrant crypt foci，ACF）的模型，并且随后的更多的有关ACF的研究进一步证实ACF模型可以代替结肠癌模型用于肿瘤早期病变及早期肿瘤化学预防研究，从而大大缩短实验周期，节约大量人力、物力和财力。但是ACF作为一种癌前病变至今尚存争议，包括ACF能否发展为腺瘤或怎样发展为腺瘤，ACF与腺瘤的关系如何，ACF－腺瘤－腺癌模式是否同样适用于人类等。因而ACF模型能否替代结肠癌模型甚至人类结肠癌用于一些科学研究尚存争议[1213]。

    本课题组的前期研究发现，ACF作为动物模型还有很多不足之处：（1）评价指标主观性强，尽管Elizabeth AML等[14]在1991详细描述了ACF的评价指标，但是观察时由于受染色效果的影响，而且介于正常和AC之间单个隐窝又为数不少，很难做到客观、准确的判断和计数; （2）病理分析困难且分级单纯，由于ACF数量多在数百，而且以含有1～3个AC的小ACF为主，不可能对每个ACF都进行病理分析，观察其异型程度，判断其是否真正具有病理学上的异型性，而且即使选择较大ACF取材做病理，在进行病理切片时也很难找到具有异型性的隐窝。另外，对切片上能看到的具有异型性的隐窝，其病理分级也多是轻度异型，因而病理学分析意义不大；（3）ACF对于观察肿瘤发生过程，初步筛选具有肿瘤化学干预作用的药物有一定的价值，但是由于很难选择性的切取病变粘膜或组织，不利于分析肿瘤发生早期阶段的分子生物学变化及研究药物作用机制、作用的靶蛋白或靶基因。微切技术虽然可以选择性切取单腺管，但是在有限的时间内切取足够分子生物学研究所需的组织量还是有一定难度，尽管有人用此技术分析过小腺瘤的APC基因突变，多数还是集中在形态学上的研究[1516]。

    本试验通过联合应用结直肠癌诱导剂DMH和PPARγ受体拮抗剂GW9662在短期内（12周）成功诱导出结直肠散发性腺瘤。腺瘤诱导成功率和荷瘤数分别为87.5％和2.0，显著高于单独应用DMH实验组的12.5％和0.13。而且通过使用PPARγ受体激动剂吡格列酮来拮抗PPARγ受体拮抗剂GW9662的作用，使腺瘤诱导成功率和荷瘤数分别降至28.6％和0.71。证明PPARγ受体拮抗剂GW9662的确是通过PPARγ通路发挥促进肿瘤形成的作用。同时更进一步的说明PPARγ通路在结肠肿瘤的形成和发展中的重要作用。

    实验中，息肉计数时仅仅选择了左半结直肠。根据Lamont JT等[17]的结直肠癌动物模型综述，左、右半结肠的肿瘤发生率跟诱导剂的使用剂量和作用时间密切相关，但总体来说结肠肿瘤动物模型在左、右半结肠的发生率是相似的，故推测DMH+GW9662组大鼠腺瘤的数目在绝对值增加上更多。由于本实验是对结直肠腺瘤模型的初步研究，GW9662[18]作为PPARγ受体拮抗剂目前仅仅应用于体外的细胞学研究，其在体内的药物代谢动力学特点尚未见报道，体内研究也很少，因而在药物代谢动力学、给药途径和剂量等方面有待进一步研究。

    综合分析，本试验所建立的结直肠腺瘤模型与传统的结肠癌模型和ACF模型相比具有经济、实用、高效、客观的优点，可以弥补两个传统模型的不足之处。该腺瘤模型诱导时间短、腺瘤荷瘤率较高、评价客观且可以形成一定的组织量，为肿瘤机制、治疗等研究带来便利。

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