TFPI2基因克隆及其在胰腺癌细胞中的表达

作者：孙振阳    作者单位：230001 合肥，安徽医科大学附属安徽省立医院普通外科

 【摘要】  目的 克隆人TFPI2基因全长cDNA，构建其真核表达载体，并将其转染到人胰腺癌细胞Panc1中，检测其表达。方法 用RTPCR法从人胎盘组织中扩增人TFPI2基因，并将其与真核表达载体pEGFPC1连接，构建真核表达载体pEGFPC1TFPI2。将构建的重组载体转染到人胰腺癌细胞系Panc1细胞，Western blot检测TFPI2在Panc1细胞中的表达。结果 RTPCR成功的扩增出一条约708bp的片断，扩增片断与载体连接后，经限制性内切酶酶切电泳分析和DNA序列测定证实该基因已经成功构建到载体上，转染Panc1细胞后，荧光显微镜观察到稳定转染细胞发出较强绿色荧光，Western blot技术证明TFPI2基因能在Panc1细胞中稳定表达。结论 成功构建了人TFPI2基因的真核表达载体pEGFPC1TFPI2，获得了稳定表达TFPI2的Panc1细胞，证实TFPI2基因能够在人胰腺癌细胞系Panc1中高效、稳定的表达，为进一步研究其胰腺癌迁移、浸润及转移中的作用打下基础。

【关键词】  胰腺肿瘤 真核表达载体 组织因子途径抑制物

    组织因子途径抑制物2( tissue factor pathway inhibitor2,TFPI2)是一种新近发现的丝氨酸蛋白酶抑制物，可能在维持细胞外基质（extracellu larmatrix,ECM)结构完整以及调控肿瘤细胞浸润转移方面起着重要作用。我们通过克隆人TFPI2基因、构建其真核表达载体，并将其转染胰腺癌细胞系，以便进一步探讨其对胰腺癌细胞生长、浸润及转移的影响。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    人胰腺癌细胞系Panc1购自中科院细胞库；DMEM培养基购自Hyclone公司；RNA 抽提试剂 Trizol Regent 购自 Gibco BRL 公司；RTPCR 试剂盒购自Promega 公司；DNA 聚合酶 pfu、dNTP 购自申能博彩公司；限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ、T4DNA连接酶购自 NEB 公司；质粒抽提试剂盒、DNA 凝胶回收试剂盒购自华舜公司；大肠杆菌DH5α、质粒pEGFPC1由本实验室保存；PCR System 2400 PCR 扩增仪购自 PE 公司；SmartSpec 3000 分光光度计购自 BioRad 公司；Lipofectamine2000转染试剂盒购自Invitrogen，多克隆抗兔TFPI2抗体，辣根过氧化物酶（HRP）标记兔抗鼠IgG，单克隆鼠抗GAPDH，DBA显色试剂盒购自Santa Cruz公司。

    1.2  方法

    1.2.1  引物设计合成  人TFPI2基因的特异性引物由宝生物工程（大连）合成，在上游引物和下游引物的5′端分别引入EcoRⅠ和SalⅠ的酶切位点（下划线序列）。上、下游引物序列分别为：5′CAGAATTCTATGGACCCCGCTCGCCCC3′和5′CAGTCGACTTAAAATTGCTTCTTCCG3′，扩增产物大小为708bp。βactin作为内参照，上、下游引物分别为5′GCTCGTCGTCGACAACGGCT3′和5′ CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC3′,扩增产物为353bp。

    1.2.2  RTPCR扩增目的基因TFPI2  取新鲜胎盘组织，切成小块立即放入液氮冻存。在液氮中将组织研碎，取约100mg按照TRIzol试剂说明提取总RNA，经凝胶电泳和紫外分光光度计分析后，按Promega公司 RNA PCR Kit 说明书操作，两步法RTPCR，先逆转录制备单链cDNA，再以逆转录产物为模板，用上、下游引物进行 PCR反应扩增目的基因，反应条件：95℃预变性5min，然后 94℃变性30s，56℃退火 30s，72℃延伸30s，进行30个循环，最后72℃延伸5min，4℃保温。扩增片段用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

    1.2.3  真核表达载体pEGFPC1TFPI2的构建及鉴定  PCR产物经酚/氯仿抽提、乙醇沉淀纯化后，进行EcoRⅠ和SalⅠ双酶切反应，用1%琼脂糖凝胶电泳回收，再与经同样处理的质粒pEGFPC1进行连接反应。取感受态大肠杆菌200μl，加10μl连接产物，冰浴10～30min。热激37℃×5min或 42℃×90s，加1ml LB培养液，振荡培养37℃×200r/min×60min,吸取 200μl 菌液涂布含筛选用抗生素的LB平板。37℃静置培养 12～16h，待其长出单克隆菌落。挑取阳性克隆扩大培养，质粒提取试剂盒提取少量提取质粒进行限制性酶酶切鉴定，并测定DNA序列。测序正确后命名为pEGFPC1TFPI2。

    1.2.4  细胞培养及转染  Panc1细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养基于37℃，5％CO2的培养箱传代培养。将传代后培养3天的Panc1细胞接种于12孔培养板，按照Lipofectamine2000说明书分别将重组质粒pEGFPC1TFPI2和空载体pEGFPC1转染到Panc1细胞，同时以未转染细胞做对照。转染48h后用含有G418的DMEM培养基选择培养，待抗性细胞克隆形成后，扩大培养，继续用G418筛选得到稳定传代的转染细胞系。

    1.2.5  荧光显微镜检测荧光蛋白表达  将稳定转染的Panc1细胞置于倒置荧光显微镜，观察绿色荧光的表达。

    1.2.6  Western blot检测转染后Panc1中TFPI2蛋白的表达  提取细胞外基质（ECM）蛋白[1]，测定蛋白浓度，制备12％的SDSPAGE凝胶，并进行蛋白质电泳，电泳分离后，恒压转移到PVDF膜上，用含5％脱脂牛奶的TBST缓冲液封闭，4℃过夜。TBST 1∶2 000稀释抗TFPI2多抗，室温培育1.5h，TBST洗5次，再用HRP标记的抗鼠二抗培育1h，显色，显影。同时以GAPDH作为内参。

    2  结果

    2.1  RTPCR扩增产物

    提取的人胎盘组织总RNA，经RTPCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳，在DNA相对分子质量700bp附近有一条亮带，与预期目的基因大小（708bp）基本一致，见图1。

    1:DNA Marker,100bp DNA Ladder；

    2:RTPCR产物；3:βactin

    图1  RTPCR扩增产物凝胶电泳

    2.2  真核表达载体pEGFPC1TFPI2 的构建及鉴定

    PCR产物经 EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后与经同样酶切的质粒 pEGFPC1连接重组，转化感受态大肠杆菌 DH5α。重组质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切鉴定片段长度与理论预测一致。此重组质粒命名为pEGFPC1TFPI2。核苷酸序列分析结果证实，PCR 扩增的 TFPI2 基因（含信号肽编码区）完全正确，引入的酶切位点与设计完全相符，见图2。

    1：DNA Marker，λ（DNA/HindⅢ+EcoRⅠ）；2：pEGFPC1的EcoRⅠ和SalⅠ双酶切；3：pEGFPC1TFPI2的EcoRⅠ和SalⅠ双酶切；4：DNA Marker: DL2000

    图2  重组pEGFPC1TFPI2双酶切电泳

    2.3  绿色荧光蛋白的表达

    在荧光显微镜下观察稳定转染的Panc1细胞中绿色荧光蛋白的表达情况，转染重组质粒pEGFPC1TFPI2的 Panc1细胞可见绿色荧光，未转染的Panc1细胞未见到绿色荧光，见图3。

    a：未转染；b：转染

    图3  未转染及转染pEGFPC1TFPI2的

    Panc1细胞在倒置荧光显微镜下表现

    2.4  TFPI2蛋白的检测

    转染pEGFPC1TFPI2的Panc1细胞经Western blot证实有32 000、31 000和27 0003种分子量的TFPI2蛋白的表达，转染空载体pEGFPC1和未转染的Panc1细胞无任何一种蛋白的表达，见图4。

    上图:TFPI2蛋白；下图：内参GAPDH 1：未转染细胞；2：转染pEGFPC1TFPI2细胞；3：转染pEGFPC1细胞

    图4  转染及未转染pEGFPC1TFPI2细胞

    中TFPI2蛋白表达检测

    3  讨论

    TFPI 2基因位于人类染色体7q22，全长约7.0kb，广泛分布于人类肝、胰腺、肾、心、骨骼肌和前列腺等正常组织[2]，其编码产物组织因子途径抑制物2是广谱丝氨酸蛋白酶抑制物，在体外可强烈抑制纤溶酶、胰蛋白酶，基质金属蛋白酶1（MMP1）和3(MMP3)的活化。而纤溶酶、组织蛋白酶以及金属蛋白酶1（MMP1）和3(MMP3)参与ECM的重塑过程，在肿瘤细胞侵袭转移等一系列生理和病理过程中扮演重要角色[3]。因此，TFPI2可能通过对这些酶的抑制来维持ECM的结构完整，调控肿瘤细胞的侵袭转移。现已发现多种肿瘤如神经胶质瘤、绒毛膜癌、黑色素瘤以及肺癌等的发生、发展都与TFPI2基因的表达减少有关，而且肿瘤的恶性程度越高，该基因的表达就越少[47]。

    与其他肿瘤相比，胰腺癌发生转移早且较严重，有90％侵犯神经束膜、70％～80％累计淋巴结、50％累计静脉，是导致患者丧失手术机会、5年生存率低的关键原因所在。TFPI2基因对许多恶性肿瘤的生长以及浸润、转移有广泛抑制作用的特点已引起人们的关注，我们从人胎盘组织成功克隆了TFPI2基因，并构建了其真核表达载体pEGFPC1TFPI2，而且将其稳定转染到人胰腺癌细胞系Panc1细胞，获得了稳定表达TFPI2基因的细胞克隆，为进一步探讨TFPI2在胰腺癌细胞侵袭转移中的作用、胰腺癌的临床预后及其基因治疗提供了实验依据。

【参考文献】  ［1］ Neaud V,Hisaka T,Monvoisin A,et al.Paradoxical proinvasive effect of the serine proteinase inhibitor tissue factor pathway inhibitor2 on human hepato elluar carcinoma cells[J].J Biol Chem,2000,275(45):3556535569.

[2] Rao CN, Reddy P, Reeder DJ, et al.Prokaryotic expression, purification, and reconstitution of biological activities (antiprotease, antitumor, and heparinbinding) for tissue factor pathway inhibitor2[J]. Biochem Biophys Res Communi,2000, 276(3): 12861294.

[3]Rigg As,Lemoine NR.Adenoviral delivery of TIMP1 or TIMP2 can modify the invasive behavior of pancreatic cancer and can have a significant antitumor effect in vivo[J].Cancer Gene Ther,2001,8(11):869878.

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[6] Ruf W,Seftor EA,Petrovan RJ,et al.Differential role of tissue factor pathway inhibitor 1 and 2 in melanoma vasculogenic mimicry[J].Cancer Res, 2003, 63(17): 53815389.

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