乳腺癌组织中ERα、ERβ蛋白表达及其意义

作者单位：武汉大学中南医院，湖北 武汉 430071       【摘要】  ［目的］ 探讨雌激素受体亚型在乳腺癌发生和发展中的作用。［方法］ 应用免疫组化技术及医学图像分析仪检测正常乳腺组织（30例）、单纯性增生组织（26例）、不典型增生组织（22例）及乳腺癌组织（26例）中ERα、ERβ及Ki67的阳性细胞百分率及灰度值，分析相应抗体的表达量。［结果］ ①与正常乳腺组织比较，乳腺癌患者组织中ERα阳性细胞百分率（58.34±64.43）及灰度值明显升高（102.17±11.89）（P＝0.05，P=0.07）；②ERβ的阳性细胞百分率在正常乳腺组织（58.40±63.36）中高于不典型增生组织（37.79±33.35）（P＝0.047），而后者又高于乳腺癌组织（18.42±49.24）（P＝0.001），ERβ的灰度值在正常乳腺组织（91.63±104.68）中也高于不典型增生（62.09±111.05）（P＝0.035）；③不典型增生周围组织及癌旁组织中ERβ的表达水平高于病变组织中；④Ki67的表达水平与ERβ的表达呈负相关（rs=－0.61，P=0.001），与ERα表达无显著性相关（rs=－0.013，P=0.989）。［结论］ 在乳腺癌发生的不同病理阶段ERβ表达量是逐渐降低的，推测ERβ的表达降低与乳腺癌的发生有关。

   【关键词】  乳腺肿瘤

    随着乳腺癌中ERα、ERβ相继被发现，该受体得到了广泛的研究，但大多数是对mRNA水平的表达变化的研究。ERβ的表达水平比ERα低得多，获得高特异性的ERβ单克隆及多克隆抗体较为困难，因此，ERβ蛋白水平的研究相对缓慢，直到2000年才开始有零星的报道[1]。

    近年来对ERβ研究的深入，人们认为受体真正发挥作用要有蛋白的表达和功能，因此ERβ蛋白水平的研究同样或更为重要。本研究应用免疫组化技术及图像分析仪检测正常乳腺组织、不典型增生及乳腺癌组织等不同病理变化过程中ERα和ERβ蛋白表达量的变化，以探讨ERα和ERβ在乳腺癌发生、发展中的作用及意义。

    1   材料与方法

    1.1   研究对象

    收集2001年1月～2003年12月期间武汉大学中南医院妇科的手术标本，每例样本均作病理确诊。其中乳腺纤维瘤（取其正常乳腺组织）30例、乳腺增生（单纯性）26例、不典型增生22例、乳腺癌标本68例。组织经甲醛固定，石蜡包埋备用。所有患者术前均未经过治疗。

    1.2   方   法

    1.2.1   主要试剂

    单克隆抗体ERα和ERβ抗体：美国Sanata Cruz公司生产。常规免疫组化试剂盒SP及 Ki67抗体：福州迈新试剂公司生产。

    1.2.2   实验方法

    分别取手术切除的乳腺组织石蜡块，每块连续切取7张5μm厚的切片，1张HE染色，核实病理诊断，另2张应用SP试剂盒进行免疫组化染色。分别用兔抗大鼠ERα、ERβ及Ki67抗体，孵育切片（4℃，过夜），再用生物素化的鼠抗兔二抗孵育30min，37℃，DAB显色5～10min。每步骤间用0.01mol/L PBS 充分洗涤，常规脱水、透明、封片、镜下观察、摄片。另一张不加抗体作为阴性对照。在显微镜下观察形态学变化，染色成棕黄色颗粒者为阳性，每张切片随机取5个视野，计算每视野中每100个细胞中阳性细胞数（百分数），其平均值为该张切片的表达水平。使用医学图像分析仪（TN-8502 Image Analysis System）测定细胞灰度值，用OS-9数据分析软件分析相应抗体的表达量，每张切片随机取5个视野，其平均值为该张切片的灰度值。

    1.3   统计分析

    应用SPSS 10.0软件包，对各组间的细胞阳性百分率，采用Kruskal-Wallis检验，配对资料采用Wilcoxon检验，灰度分析采用t检验，相关分析采用Spearman分析，P<0.05认为差异有显著意义。

    2   结   果

    2.1   ERα、ERβ在乳腺良性病变及乳腺癌组织中的表达

    正常乳腺组织中ERα的阳性细胞平均百分率为35.53±57.25，单纯性增生及不典型增生组阳性细胞百分率分别为45.98±59.76、44.26±59.94，三组比较差异无显著性。乳腺癌组织为58.34±64.43，与正常乳腺组织比差异有显著性（P=0.005）。随着病变程度的增加，阳性细胞的灰度值也是增加的，不典型增生组织(95.71±93.65)及乳腺癌组织(102.17±11.89)高于正常组织(68.22±102.43)，经统计学处理，差异有显著性（P=0.04，P=0.007），见表1。说明乳腺癌组织中ERα表达水平是升高的。

    在正常乳腺组织（58.40±63.36）及单纯增生性组织（47.48±64.64）中ERβ的阳性细胞平均百分率高于不典型增生组织（37.79±33.35）（P＝0.047），而后者又高于乳腺癌患者（18.42±49.24）（P＝0.001）。ERβ阳性细胞的灰度值在不典型增生（62.09±111.05）及乳腺癌患者（37.31±92.73）也逐步降低，经统计学处理，差异有显著性（P＝0.035，P＝0.001），见表2。提示从简单型增生、不典型增生到乳腺癌发展的不同病理过程中ERβ表达量是逐渐降低的。

    2.2   ERβ在病变旁组织组织中的表达

    乳腺简单性增生、不典型性增生及乳腺癌组织中，同时取其周围组织进行ERβ表达水平的分析。发现在不典型增生周围组织及癌旁组织中ERβ的表达水平高于病变组织，差异有显著性（P<0.05），而在简单型增生组织中，其周围组织与病变组织比较，两者表达水平差异无显著性，见表3。同时比较三组病变旁组织的平均阳性细胞数及阳性细胞灰度，发现三组间差异无显著性（P>0.05）。

    2.3   ERα及ERβ与Ki67表达的关系

    同时检测同一组织中Ki67的表达水平，发现正常乳腺组织中Ki67阳性细胞平均百分率为22.58±52.8、简单性增生为20.52±51.47、不典型增生为29.13±61.13、乳腺癌为66.7±73.52。中位百分数分别为6.10％、12.2％、26.9％及33.4％。Ki67的表达水平与ERβ的表达呈负相关（rs=－0.61，P=0.001），与ERα表达无相关性（rs=－0.013，P=0.989）。

  3   讨   论

     乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤之一。研究资料提示，雌激素是乳腺癌重要的有丝分裂刺激剂，这种促分裂作用是通过乳腺组织中的雌激素受体（ER）介导。就其功能而言，ERα和ERβ均可通过两种方式介导基因转录：①通过经典的雌激素反应元件进行信号传导；②通过AP1增强子元件进行信号传递。当通过AP1位点进行信号传递时，ERα和ERβ发挥不同的生物活性，这提示ERα和ERβ在乳腺癌中的表达可能有重要临床价值。

    ER受体亚型在肿瘤发生发展中的作用目前尚未形成一致性结论[1~5]。有研究发现，在ERα和ERβ共存的乳腺癌及卵巢肿瘤发生过程中，ERβ表达降低而ERα增加[6~8]。结肠癌组织中ERβ表达也明显降低[9]，结肠病变的恶性转化与ERβ蛋白减少有关[10]。但另有研究表明胃癌、结直肠癌患者中，癌组织与正常组织中ER表达无明显差异，而且患者的ERβ表达与性别、肿瘤分级或分期无关，认为ERβ表达是组织特征，而不是恶性过程的结果[11]。

    Gustafsson[12]为了明确ERβ在正常乳腺及乳腺癌中的作用，设计一种ERβ基因失活即ERβ基因敲除鼠，显示其乳腺上皮增生Ki67过度表达。随着鼠年龄增加，出现严重的囊性乳腺病，因此认为ERβ对正常乳腺有保护作用。Lazennec[13]研究发现ERβ在乳腺癌中表达水平比正常乳腺组织明显降低，为了明确ERβ在乳腺癌致癌中是否起作用，将ERα和ERβ均为阴性的乳腺癌细胞系通过腺病毒转染ERα（＋）或ERβ（＋），用RT-PCR及Western blot方法检测到了ERα、ERβ的表达，发现ERβ蛋白定位于核内，在雌激素存在时能反式激活雌激素反应元件。ERα和ERβ都能诱导几种内源基因的表达，如雌激素调节蛋白（PS2）、TGFα和细胞周期蛋白及酶抑制剂p21。但与ERα相反，ERβ不能调节c-myc原癌基因的表达；ERβ以不依赖配基的方式抑制MDA-MB-231细胞的增殖，ERα抑制增殖是激素依赖的，而且ERβ直接抑制MDA-MB-231细胞活力和侵袭，此研究证明ERβ是乳腺癌细胞增殖和侵袭的重要调节剂，并提示ERβ失去表达将导致乳腺癌的发生。

    从本实验研究通过检测正常及乳腺癌组织中ERα、ERβ变化以及增殖性抗原Ki67的关系来显示ERα、ERβ在乳腺癌发生中的作用。ERα在乳腺癌组织中表达量高于正常乳腺组织（P<0.05）。ERβ阳性细胞在正常乳腺组织中的百分率>简单型增生乳腺组织>不典型增生乳腺组织>乳腺癌组织，其表达量表现为由多到少的量变过程，并且ERβ的表达水平与Ki67表达水平呈负相关。同时我们取病变周围组织进行ERβ表达水平的分析，发现在不典型增生周围组织及癌旁组织中ERβ的表达水平高于病变组织。上述实验结果提示，雌激素可能通过ERα刺激某些已经损伤的细胞走向恶性化，而ERβ则能抑制细胞的分裂活动进而避免恶化。ERα、ERβ在乳腺致癌过程中这些改变，提示ERα和ERβ特异途径在致癌过程中的决定性作用。

    综上所述，在乳腺癌发生的不同病理阶段ERβ表达量是逐渐降低的，推测ERβ的表达降低与乳腺癌的发生有关。但是，ER变化在乳腺癌的发生、发展中的更深层意义还有待于大量的基础研究和前瞻性的临床研究。

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