hWAPL基因在宫颈癌及宫颈上皮内瘤变中的研究进展

作者           单位

刘春艳     四川，泸州医学院

毛熙光     四川，泸州医学院

hWAPL基因是近年来发现的一个调节细胞染色体结构的一个基因，在宫颈癌组织中特异性高表达，具有癌基因的特性，其相应的RNAi能明显抑制细胞hWAPL的表达并促进细胞凋亡，是宫颈癌基因治疗的一个潜在靶点。本文对hWAPL基因在宫颈癌及宫颈上皮内瘤变中的研究进展进行综述。

1WAPL基因概述

半翼基因(WAPL)是于1977年在黑腹果蝇体内发现的一个基因，位于果蝇体内X染色体2D5-2D5，编码的蛋白质的主要功能是维持姐妹染色单体的粘合，同时在异染色质结构的调节中起重要作用[1]。

黏连蛋白(cohesion)形成的黏着力使姐妹染色单体紧密的连在一起，黏连蛋白的作用是在细胞周期中调节染色体的正确分离，它是一种多个亚基的环状蛋白质复合物，在S期和姐妹染色单体结合，而后从染色体上分离[2]。Gandhi等[1]证实，WAPL蛋白直接作用于黏连蛋白，使其从染色体上解离。进一步研究发现WAPL蛋白通过和黏连蛋白的两个调节亚基结合，从而形成一个三元复合体，WAPL蛋白作用于黏连蛋白的两个调节亚基促进黏连蛋白的分离，在有丝分裂前期，WAPL蛋白可以直接促进黏连蛋白的解离。

人半翼基因(human wings apart-like，hWAPL)是WAPL基因在人类的同源基因，hWAPL基因位于染色体10q232位点，长约86528bp，含有17个外显子和2个内含子，其编码的hWAPL蛋白与WAPL蛋白保守区域高度同源(34%相同，56%相似)，因此二者功能也相似，都与染色质结构的调节有关，若其过度表达，则会使得姐妹染色单体过早解离[3]。

2007年，Ohbayashi等[4]将含有绿色荧光蛋白和hWAPL的载体向Hela细胞转染后，发现在EGFP-hWAPL阴性的细胞中细胞周期正常，而在EGFP-hWAPL阳性的细胞中处于S期的细胞数目增多，且多倍体DNA含量和染色体断裂的数目也增加。这表明hWAPL蛋白的过度表达可以诱导染色单体断裂，非整倍体的产生或产生多核细胞，促进染色体的不稳定性的形成，并且干扰了细胞有丝分裂过程，促进肿瘤发生。Gandhi等[1]向293T细胞转染含hWAPL蛋白表达载体，发现hWAPL蛋白的过度表达使细胞异常有丝分裂的细胞增多，并且早熟姐妹染色单体的分离率明显增高，如染色体异常排列数目增加、多极纺锤体形成增加。hWAPL蛋白缺失后则阻止了黏连蛋白从染色体臂上脱离，这导致了黏连蛋白表达量增加，细胞短暂的停留在前中期，且在细胞分裂后期出现多分裂核现象。

体外实验中，Oikawa等[5]将血凝素(HA)标记的hHWPL基因表达载体(HA-hWAPL 3T3)及HA表达载体(HA-3T3)转染鼠成纤维细胞，并将转染后的细胞分别注入裸鼠体内，观察经注射后的裸鼠的成瘤情况，结果发现，转染HA表达载体的裸鼠没有肿瘤发生，而转染了HA-hWAPL 3T3的裸鼠均有肿瘤发生，并用Western印迹法检测hWAPL在这些肿瘤中显著高表达，说明hWAPL基因的过度表达促进了肿瘤的发生，具有癌基因的特性。

正常小鼠睾丸组织中含有大量的WAPL蛋白，对人类各正常组织的检测发现相类似的情况，人睾丸组织中表达大量hWAPL mRNA.而其他正常人类组织表达微量的hWAPL mRNA。哺乳动物的WAPL基因对二嗯英(dioxin)很敏感，二嗯英可以使WAPL蛋白的表达下降，从而影响精子的发生。在小鼠体内WAPL基因还与胚胎的发育有关。抑制SiHa细胞中hWAPL基因表达可引起细胞的死亡。由HPV或其他因素引起的hWAPL的异常表达可导致DNA断裂或不准确修复，导致存活细胞中的基因重排或形成多倍体，引起基因组的不稳定性从而导致细胞的恶性转化和胚胎发生缺陷。

2hWAPL与HPV的关系

大量研究普遍认为HPV感染是宫颈癌和大部分CIN的主要原因，HPV病毒基因组是双链环状DNA，具有特殊的嗜上皮性。HPV感染宿主细胞后其DNA整合进入宿主细胞DNA是HPV持续感染的基本条件，在HPV DNA整合到细胞DNA的过程中常发生基因断裂，病毒El/E2基因是最常见的断裂点，E2基因编码的一个特异的DNA结合蛋白能抑制HPVE6/E7基因的表达，故E2基因的断裂使E6/E7基因持续过量表达，引起细胞转化。

hWAPL基因表达受HPV早期蛋白的影响，HPVE6、E7可以分别引起hWAPL表达的升高，也可以联合引起hWAPL表达的升高，但E6和E7联合作用与E6或E7单独作用对hWAPL表达的升高水平的影响相似。

因HPV E2蛋白可与HPV早期启动子结合抑制E6、E7的表达，为证实hWAPL的表达是由E6和E7引起的，Kuroda等分析了HPV E2对hWAPL表达的影响，用编码E2的逆转录病毒去感染表达HPV16 E6和E7的宫颈癌细胞株如与HPV阴性的宫颈癌细胞株C33A，发现CaSki和SiHa细胞株中hWAPL的表达水平显著降低，而在C33A细胞株中，hWAPL的表达没有这么明显的改变。 这些结果表明，hWAPL的表达可能是对HPV E6和E7所引起的特殊癌前细胞周期的一种反映。

3hWAPL基因与宫颈疾病的关系

宫颈癌是全球女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于乳腺癌。目前宫颈癌发病趋于年轻化，严重影响广大女性的健康。近来，研究发现hWAPL基因是仅在宫颈癌组织中特异性高表达，与宫颈癌的发生有密切关系。

Oikawa等用Nothern blot检测宫颈癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结肠癌、肾癌及相应正常组织中的hWAPL基因的mRNA表达，并分别检测宫颈癌、癌前病变和正常宫颈组织中hWAPL mRNA及蛋白的表达水平，发现相对于其他组织，宫颈癌组织中hWAPL mRNA表达显著高于正常宫颈组织和其他组织;在CINⅢ和宫颈癌组织中hWAPL mRNA的表达与正常宫颈组织相比显著升高，且随CIN病变严重程度的加重，hWAPL mRNA的表达也逐渐增强。也许是随着hWAPL的表达增多，在宫颈细胞进行有丝分裂的时候，细胞染色体会出现更多的断裂或碎片的变异，这些变异可能引起遗传物质的改变或多倍体的形成，从而使宫颈细胞癌变。Oikawa等进一步发现在正常宫颈中，hWAPL基因的表达仅限于上皮基底层，在CIN I-Ⅲ至宫颈癌组织中的表达量逐渐增加，且逐渐累及上皮全层，hWAPL的免疫染色积分(staining score)也逐步升高。过程中起着重要的作用。鲁笑钦等[6]也采用免疫组化的方法检测到宫颈癌组织中hWAPL蛋白的特异性高表达。

Kuroda等在成人皮肤上皮角质细胞(HDK1)中导入表达HPV16 E6和E7的逆转录病毒后，发现E6和E7都可引起hWAPL在HDK1细胞中的大量表达。在HPV阳性的正常宫颈组织中，hWAPL表达较低，而无论在HPV阳性还是阴性的宫颈癌细胞株中，hWAPL表达均较强，说明相对于HPV来说，hWAPL基因的过度表达也许是宫颈癌发生的更直接原因。

在宫颈癌细胞系中导入hWAPL基因的特异性小干扰RNA(siRNA)，发现能明显抑制 hWAPL基因的表达，从而导致这些细胞死亡;而siRNA对hWAPL基因低表达的细胞系抑制作用则不明显。Kuroda等设计了hWAPL双链的小片段干扰性RNA(siRNA)，siRNAⅠ和siRNAⅡ，将其转染宫颈癌细胞株SiHa中，来检测siRNA对hWAPL的抑制的效应。结果显示，siRNAⅠ有更强的降低hWAPL mRNA的作用，hWAPL蛋白表达水平在siRNAⅠ转染后也显著降低，siRNA能明显抑制肿瘤细胞的增长并诱导细胞凋亡，而siRNAⅠ则对hWAPL表达较低的Saos-2和HCTl 16细胞没有任何作用。利用流式细胞技术分析对hWAPL基因特异性抑制的siRNA转染后的细胞的结局，发现转染后处于S期的细胞数量增多，且多数在G2-M期凋亡。另外，后G1期的凋亡细胞增加，表明hWAPL途径可能起S期调控点或其他凋亡路径的作用。Kuroda等注射宫颈癌SiHa细胞株至裸鼠皮下，使其产生肿瘤，一周后，隔天注射对hWAPL基因特异性抑制的siRNA，共三周，和阴性对照siRNA及未注射siRNA的肿瘤相比，hWAPL基因特异性抑制的siRNA可显著抑制肿瘤的生长，引起肿瘤组织的坏死。

曹利仙等[7]设计合成hWAPL基因的短发夹RNA(shRNA)，将其克隆至带增强绿色荧光的表达载体pGenesi-l中，经酶切和测序后，转染到中，根据荧光表达来测定转染效率，同时设置阴性对照和非干扰组两个对照组，转染48h后收集细胞，检测hWAPL的表达情况和细胞生长情况，结果表明，与两个对照组相比，hWAPL siRNA转染组的hWAPL mRNA水平明显降低，细胞生长受到明显抑制，说明本研究所用的hWAPL siRNA能够特异性地抑制CasKi细胞的hWAPL基因的表达。

4展望

hWAPL基因在宫颈癌中特异性高表达，并且hWAPL基因相对应的siRNA可以明显抑制hWAPL的表达从而影响细胞的周期，说明hWAPL基因可能成为一个有效的治疗宫颈癌的靶点。但对hWAPL基因的更多特性及其在宫颈癌中的具体作用机制还需进一步研究。

【参考文献】

[1]Gandhi R，Gillespie PJ，Hirano T.Human wapl is a cohesion-binding protein that promotes sister-chromatid resolution in mitotic prophase[J].Curr Biol，2006，16：2406-2417.

[2]Rowland BD，Roig MB，Nishino T，et al.Building sister chromatid cohesion：smc3 acetylation counteracts an antiestablishment activity[J].Mol Cell，2009，33：763-774.

[3]Le Sot N.Wapl takes cohesin off chromosome arms[J].Nat Cell Biol.2007，9：21.

[4]Ohbayashi T，Oikawa K，Yamada K，et al.Unscheduled overexpression of human WAPL promotes chromosomal instability[J].Biochem Biophys Res Commun，2007，356：699-704.

[5]Oikawa K，Akiyoshi A，Tanaka M，et al. Expression of vafious types of alternatively spliced WAPL transcripts in human cervical epithelia[J]. Gene. 2008.423：57-62.

[6]鲁笑钦，崔金全，胡滨.Hwapl基因在宫颈癌组织中的特异性表达及意义[J].医药论坛杂志，2007，28：1-2.

[7]曹利仙，潘巍巍，黄玉蓉,等. hWAPL基因shRNA真核表达载体的构建及干扰效果的初步鉴定[J]，解剖学杂志，2010,33