Caspase-3表达强度评价新型医用高氮无镍奥氏体不锈钢的生物相容性

　　医用不锈钢由于具有适宜的力学性能、加工性　　能和低成本等优势，迄今为止，仍在口腔医学和骨科人工关节、骨折内固定器械中被广泛应用川。然而，在生物体复杂的生理环境中，不锈钢材料不可避免会发生腐蚀或磨损，并释放出金属离子，相应会带来力学性能和生物相容性等方面的问题。在离体研究中，金属材料的溶出产物如镍(Ni)、铬(Ur),铂(Mo)等金属离子显示出不同程度的细胞毒性[?.3-新型无镍奥氏体不锈钢(BIOSSN4)是以人体宏量元素氮作为奥氏体化元素，摒弃了钢中对人体有害的镍元素，有望进一步提高不锈钢材料在体内长期使用的安全性。目前，研究证明BI()SSN4具有良好的耐腐蚀性能和综合力学性能，但国内外对其生物相容性的研究较少。本文采用体外试验，利用L929细胞与金属合金浸提液直接接触，Ho-echst33342/PI双染观察细胞形态，检测凋亡相关基因Caspase-3活化度，探讨细胞凋亡与口腔材料生物相容性的关系，尝试从凋亡的角度来评价细胞毒性的程度。　　1材料与方法　　材料　　1.1.1实验样品的分组实验组A:BIOSSN4组(中科院金属研究所);对照组B;317I、组(中科院金属研究所);对照组C:钻铬合金组(Stellite，上海);对照组D:金合金组(Heraeus，德国):对照组E:空白组。金属材料成分见表1.　　1.1.2金属试件制备制作半径5mm、厚1mm的圆形蜡片(面积1.88cmz，根据不同合金的要求铸造形成圆形金属片，打磨抛光后9500酒精超声清洗15min;去离子水冲洗数遍(至少3遍)后置于玻璃小瓶中，将金属片于121℃高压灭菌后待用。　　1.2培养液及主要试剂RPM工一1640培养液CServa,Germmany)(含纯牛胎血清，青霉素100mg/L，链霉素100mg/L,pH一7.2),Ho-echst33342/P工试剂盒(南京凯基)。caspase-3分光光度法检测试剂盒(南京凯基),Bradford蛋白定量检测试剂盒(南京凯基)。　　1.3主要仪器和设备24孔培养板，75cm-培养瓶，CO}培养箱(Heraeus，德国)，超净台(苏净集团安泰公司)，高速离心机(Sorvall公司，美国)，分光光度计<PYE-U}ICAM/SPECTR()N工C，美国)，荧光显微镜(OlympusIx74(Olympus公司，日本)。　　1.4实验方法　　1.4.1浸提液制备无菌下将各金属圆片置于24孔板中，每孔1金属片加2mL(此值在ISo标准对离子析出测试所要求的范围。.5^-6.0cm'/m汀0y含10%胎牛血清RPMI1640培养液(同时设立阴性对照)，在370C,50oC0:条件下连续浸提72h后待用。　　1.4.2细胞培养及加样培养细胞培养及细胞传代:工929细胞用含10%胎牛血清的RPM工1640细胞培养基于100m工、培养瓶中在370C,5%的COQ培养箱中培养。约3}4d进行细胞传代。当培养细胞密度约7000^80%时传代。弃培养瓶中培养液;加0.25%胰酶中和残余培养液后倒掉胰酶;再次加少量胰酶消化贴壁细胞2^-3min;向培养瓶中加10mL培养液并轻轻吹打瓶壁使细胞脱落;按1:7比例传代培养于75mI培养瓶中。加样培养:待培养细胞密度约3000^40%时换无血清培养基培养24h。弃原培养液并用PBS缓冲液洗细胞3遍，后将各材料浸提液(包括阴性对照)各4mI加于培养瓶中，370C,50oC0:条件下培养细胞4h后待测。　　1.4.3Hoechst33342/PI双染收集并取1'105个细胞悬浮于1m工培养基中.再加人10.Ho-echst33342染液.混匀，370C孵育15min;细胞于40C,1000r/min，离心5min，弃去上清液;加人1mIBufferA工作液(用双蒸水将10XBufferA稀释10倍)悬浮细胞，加入5尸一PI染液，室温避光放置15mm后混匀。将[述染色后细胞悬液滴加于载玻片仁，并用盖玻片盖上细胞，置于荧光显微镜下，双色滤光片(FITC和罗丹明)观察。　　1.4.4caspase-3含量检测检测方法:1)吸取50川含100-200}g蛋白的细胞或组织裂解上清;如体积不足50川用工ysisBuffer补足至总体积”I_(各组均采用同样的蛋白量进行测定和比较);2功口人50uL的2YReactionBuffer(注意:使用前每50}I_2XReactionBuffer加人0.5}LDTT);3)加人5}LCaspase-3底物N一乙酞一天门冬氨酞一谷氨酸一撷氨酸一天门冬氨酞-7-氨基一4一甲基一香豆素(AC-DEVD-pVA)并于37℃避光孵育4h;4)用分光光度计(100}L的比色皿)在400nm测定其吸光值。通过计算A诱导剂/A阴性对照的倍数来确定凋亡诱导剂组Caspase-3活化程度。　　1.5统计学分析所有计量资料以;表示，使用SPSS13.。软件对结果进行统计学分析。采用组间单因素方差分析进行统计学分析，PCO.05表示差异显著。　　2结果　　2.1经Hoechst33342/PI双染，正常活细胞呈弥散均匀低蓝色荧光，核呈正常结构;早期凋亡细胞核或细胞质内可见浓染致密颗粒状的高蓝色荧光(白色箭头所示);晚期凋亡细胞.染成红色，但可见明显的染色质凝集(红色箭头所示);坏死细胞呈高红色荧光，核呈正常结构，见图1.　　2.2Caspase-3活性测定见表2各组材料Caspase-3活性由小到大依次为:空白对照组(E><金合金组(D)GBIOSSN4组(A)<钻铬合金组CC>G317I、不锈钢组(B)。各组之间Caspase-3活性有显著性差异(P<0.05).　　3讨论　　生物相容性是指材料在宿主的特定环境和部位，与宿主直接或间接接触时所产生相互反应的能力，是材料在生物体内处于静动态变化过程中，能耐受宿主各系统作用而保持相对稳定，不被排斥和破坏的生物学性质川。生物材料对宿主的生长影响.一直是评价生物材料生物相容性的关键性指标之一。生物材料植人人体后可影响植人部位组织细胞增殖、分化及凋亡所构成的动态平衡几。生物材料生物相容性的检测一般包括体内实验和体外实验。由于生物个体差异，体内实验易受诸多混杂因素的干扰和影响，不易定量研究材料及其析出物对机体的影响，而体外细胞培养法在评价生物材料对细胞生长、代谢及增殖影响方面能够快速有效的进行毒性筛选实验，实验条件易于控制.重复性好，灵敏度高，有利于缩短生物材料研究周期川本实验即采用体外实验的方法，将试样材料浸提液与细胞共培养，观察细胞形态及Caspase-3表达情况。　　口腔金属材料在与口腔组织接触时，唾液会对金属产生腐蚀作用，导致金属离子及其衍生物析出，如Ni,Cr,M。等，显示出不同程度的细胞毒性LgJ镍是医用奥氏体不锈钢中的主要合金元素，其主要作用是形成并稳定奥氏体，从而使钢具有良好的强度、塑性及韧性的配合，并具有良好的冷热加工性以及良好的焊接等性能。然而过量的镍元素除了对机体产生过敏反应外，还存在致畸、致癌的危害。有研究表明.含镍医用金属试样在模拟体液的浸泡过程中镍离子的释放量随着浸泡时间延长，镍离子释放量逐渐增加C}J。镍离子可抑制DNA的合成与复制，改变DNA结构，降低蛋白质合成并影响碱性磷酸酶活性来抑制细胞的增值能力。1994年颁布的欧洲会议标准94/27/EC标准，对植人人体内的材料(如医疗植人物、牙科材料等)规定，镍含量不应超过。针对医用不锈钢的应用广泛和其中镍的危害性，最近几年一些研究人员提出把高氮含量的Cr-Mn-N系列无镍奥氏体不锈钢应用于生物医学这种不锈钢不仅具有优良的抗腐蚀能力及高强的韧性组合，更重要的是钢中不含镍元素，从而可以避免镍离子析出造成的毒性反应。凋亡因其可以从形态、分子、蛋白、基因等不同深度层次进行检测，是检测口腔材料生物相容性的新方法，在精确性和重复性方面具有很大的优越性。本试验正是从分子水平上利用细胞凋亡相关因子caspase-3来评价此种不锈钢材料的生物相容性。　　本实验采用的Hoechst33342/PI双染法是国际公认的快速检测细胞凋亡的便捷方法。Ho-echst33342荧光染料能少许进人正常细胞膜.使其染上低蓝色，而凋亡细胞的膜通透性增强，因此进入凋亡细胞中的Hoechst33342比正常细胞的多，荧光强度要比正常细胞中要高;此外，凋亡细胞的染色体DNA的结构发生了改变从而使该染料能更有效地与DNA结合，并且凋亡细胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到损伤不能有效地将Hoechst33342排出到细胞外使之在细胞内积累增加等都使凋亡细胞的蓝色荧光增强。而PI染料不能进人细胞膜完整的正常细胞和凋亡细胞中，即活细胞对PI染料拒染，而坏死细胞由于膜完整性在早期即已破损，可被PI染料染色本实验根据这些特性，先进行Ho-echst33342活细胞染色，再进行PI染色，在荧光显微镜下可见4种细胞形态学变化:活细胞，染成低蓝色，核呈正常结构;早期凋亡细胞，染成高蓝色，核呈固缩状或圆珠状;晚期凋亡细胞，染成红色，但可见明显的染色质凝集;坏死细胞，也被染成红色，核呈正常结构。本实验Hoechst33342/PI荧光双染镜下可见明显的凋亡细胞，部分细胞核物质边集，出现明显的凋亡小体及核碎片，进一步直观地验证各实验组金属合金材料可引起L929细胞凋亡，并随加样作用时间延长细胞凋亡数量增多，各实验组间凋亡率有差异。　　在细胞凋亡过程中，Caspase-3作为凋亡的中心执行者，起着至关重要的作用。分析Caspase的活性可较许多其他方法更能检测细胞凋亡的早期事件。由表1可知，各组材料Caspase-3活性由小到大依次为:空白对照组(E><金合金组(D>GBIO-SSN4组(A)<钻铬合金组(C)G317L不锈钢组(B}。金合金被证实具有良好的生物相容性性f121317工、不锈钢Caspase-3活性高表达可能与其释放出的镍离子有关。镍离子可引起DNA合成和复制抑制，DNA结构改变，蛋白质合成降低以及影响碱性磷酸酶活性等一系列生物效应。钻铬合金组中Caspase-3表达较金合金组高较317L不锈钢组低是由于其不含镍离子但含较高比例的钻铬离子。钻铬离子对细胞具有一定的细胞毒性，刺激细胞释放RANKLOPG，降低细胞活力.BIOSSN4组引起的Caspase-3活化程度介于金合金与钻铬合金组和3117L不锈钢组之间，缘于其成分中无镍离子且钻铬离子所占比例均较小。　　细胞凋亡试验可从形态、分子、蛋白和基因等不同深度层次进行检测，实验的精确性高和重复性好，选用凋亡途径作为检测评价医用不锈钢生物相容性的一种新方法，具有广阔的研究前景。实验结果表明新型医用高氮无镍奥氏体不锈钢生物相容性介于金合金与钻铬合金和3171、不锈钢之间，是一种无毒材料，可为临床安全应用提供一定的理论依据。　　参考文献　　顾其胜，侯春林，徐政.实用生物医用材料学[M].上海上海科学技术出版社，2005:158.　　David A. Lobner D. In vitro cytotoxicity of orthodontic arch-wires in cortical cell cultures[J]. Eur J Orthod, 2004.26（4):421一426　　AI一Hiyasat AS, Darmani H, Bashabsheh OM.  Cytotoxicityof dental casting alloys after conditioning in distilled waterr[J].IntJ Prothodont, 2003 .16（6):697一601