多效生长因子在牙周炎治疗前后的表达情况
发表时间：2014-07-30 浏览次数：1061次
PTN是二十世纪十年代Bl,hlell等从成体牛脑中分离纯化出的一种可以与肝素结合的蛋白质,人πl称其为多效生长囚子.作为一种肝素结合生长因子对于细胞的生长分化及迁移、创伤修复、肿瘤的生长、炎症反应、胚胎发育等都有着重要的作用。近年来的研究发现,PTN的表达与炎症的发生发展密切相关。本研究应用RT_PCR、原位杂交方法在基因水平检测了PTN与牙周炎中相关关系。
资料和方法
一、标本
1,制各:7周龄雄性Wistar大鼠50只(哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供),体重100~150g,牙列完整,牙周牙体无损伤、发育异常和炎症。按随机设计原则,分为炎症组和恢复组,每组⒛只,炎症组和恢复组分别施以实验因素。对照组10只。炎症组和恢复组大鼠用正畸结扎丝于实验牙牙颈部龈缘水平进行结扎,用(果糖笳%,脱质奶粉28%,面粉6%,酵母4%,苜宿粉3%,动物肝粉1%,食盐2%及少量蔬菜)喂养六周,炎症组大鼠制取标本。六周后恢复组大鼠除去结扎丝进行牙周基础治疗六周后制取标本。所有标本保存于液氮中。
2牙周炎诊断标准:牙龈的炎症和出血,牙周袋形成,牙槽骨吸收,牙松动和移位。
3.炎症组诊断指标:牙龈的色形质,牙周袋探诊深度≥4mm且探诊出血,附着丧失。4.恢复组检查指标:牙龈的色形质趋于正常,牙周袋探诊深度≤3mm且不出血。
二、主要试剂TaKaRa RNA PCR KIT(AMⅤ)Ⅴer。3,0、TaKaRa Taqm、TRIZOL(大连宝生物工程有限公司),PTNmRNA原位杂交检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司),引物:正义引物:5′-AGAGAGGAC-GTTTCCAACTC-3′,反义引4勿:5′-GCAATAGTT-AACTGAATCCTG-3′,(北京赛百盛公司合成)。
三、方法RT_PCR∶取组织50mg采用TRIZ01。一步抽提法提取总RNA,而后进行反转录,条件:绲℃绣血n,∞℃5m血c PCR条件:9ZI℃预变性3min,然后℃变性3“cc,61℃退72℃延伸30sec,共35个循环,之后72℃延伸10min。PCR产物在含EB的1,5%琼脂糖凝胶上分离、检测。原位杂交:3um厚连续切片分别进行HE染色和MK原位杂交。操作步骤按照试剂盒说明书进行[细胞质中出现清晰棕黄色颗粒的细胞为阳性细胞:结果以阳性细胞数所占比例表示,光境(×硐0)下随机选取10个视野,每个视野计数100个细胞,阳性细胞数≤5%者为阴性(-),6~15%者为弱阳性(+),16~50%者为中强阳性,>50%者为强阳性(+|+)。4,数据处理:计量资料采用IBAs图文处理系统分析处理,采用BANDLEADER分析软件扫描分析电泳各条带的光密度值表示目的基因的表达量,同时采用SPSS10.0进行统计学处理cP硐,“有统计学意义,P<0.01有显著统计学意义。结果1RT-PCR:按照设计的引物PTN的PCR产物的大小为59tlbp,作为内对照的的扩增产物大小为308bp,PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果(图1、2)。BANDLEADER分析软件扫描分析各条带的光密度值,可见比较炎症组和恢复组样本均数,F=6298,P硐01,说明PTNmRNA的表达是有统计学意义的,在恢复期表达多。2,原位杂交:PTNmRNA的阳性产物位于牙龈上皮、龈沟内上皮和结合上皮细胞胞浆中,呈棕黄色颗粒(图3⑷。炎症组中PTNmRNA的表达主要集中于棘细胞层和颗粒细胞层,表达量为弱阳性和中强阳性:恢复组中PTNmRNA的表达主要集中于棘细胞层和基底细胞层,表达量为强阳性和中强阳性。对照组中PTNmRNA的表达较少(表1).
讨论
PTN作为一种肝素结合生长因子,PTN的结构、功能均与同族生长因子midhm相似,DNA序列有50%同源,富含碱性氨基酸和半胱氨酸,能与肝素结合并相互作用。它对于细胞的生长分化及迁移、创伤修复、肿瘤的生长、炎症反应、胚胎发育等都有着重要的作用。一些学者回研究了PTN在骨折愈合中的表达。发现骨折5天时愈合组织主要由纤维组织组成,10天时在骨折断端有软骨组织形成,15天时有编织骨形成。PTN表达于骨折断端纤维组织的纤维母细胞和内皮细胞中,软骨样组织不表达PTN,10~15天在分化良好的脉管系统和新形成的编织骨中PTN强烈表达,成骨细胞、上皮细胞、成纤维细胞中PTN强烈表达。Pu等研究骨关节炎中PTN的表达,发现PTN在正常软骨中不表达,但在骨关节炎中表达c在关节炎早期阶段滑液中可见PTN表达,晚期少见,软骨肉瘤中未见表达。牙周炎是一种慢性感染性疾病,微生物与宿主的相互作用决定了疾病的过程和进展。微生物可以通过自身代谢产物引起组织破坏,直接发挥致病作用,或通过刺激和改变宿主反应间接起致病作用.如今,随着对牙周病发病机制的进一步了解,已经清楚地认识到牙周病的大多数组织损害是由于宿主对感染的应答引起的。有研究表示MK在炎症过程中主要来源于巨噬细胞囵,我们知道巨噬细胞是慢性牙周炎先天免疫系统中的重要成员。原位杂交是用标记的核酸探针,使用非放射检测系统或放射自显影系统,在组织切片、细胞涂片及染色体制片上对核酸进行定性、定位和相对定量研究的一种分子生物学方法,具有灵敏、特异、直观等优点。目前主要应用于基因组图、基因表达定位、核DNA和RNA的排列,RNA的排列和运输、复制和细胞的分类等基础研究。临床研究应用在细胞遗传学、产前诊断、肿瘤和传染性疾病的诊断,生物学剂量测定和病毒学的病原学诊断等。本研究原位杂交检测时发现PTNmRNA的阳性产物位于牙龈上皮、龈沟内上皮和结合上皮细胞胞浆中,呈棕黄色颗粒。炎症组中PTNmRNA的表达主要集中于棘细胞层和颗粒细胞层,表达量为弱阳性和中强阳性。恢复组中PTNmRNA的表达主要集中于棘细胞层和基底细胞层,表达量为强阳性和中强阳性。对照组中PTNmRNA的表达较少。RT-PCR是一种分析基因表达的快速灵敏的方法,比其它包括Northern印迹、Rnase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术更灵敏。对于获得与克隆mRNA的5′、3′末端序列和从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库方面都是极为灵敏与通用的方法。鉴于它的高灵敏性(从小量样品中即可得到足量产物)和高特异性(选择性地仅得到所需的产物)而被应用于鉴定已转录序列是否发生突变及呈现多态性,还可用于鉴定基因表达的强度,尤其是在可获得的mRNA数量有限和目的基因表达水平很低的情况下。
RT-PCR定量检测PTNmRNA时,比较炎症组和恢复组样本均数P刹01,说明PTNmRNA的表达是有统计学意义的,在恢复期表达多,与原位杂交研究结果一致。我们研究中采用的两种方法同时进行一个水平的检测结果是一致的,RT_PCR更具直观性,原位杂交检验更为微观的表达,而且将其表达准确定位。
