复方五倍子用作髓室底穿孔内屏障材料的体外抑菌实验
发表时间：2014-07-15 浏览次数：937次
髓室底穿孔常由严重龋坏、医源性因素或病理性吸收引起,穿孔后常合并细菌感染而导致牙周组织的持续性破坏和牙槽骨吸收,因此理想的穿孔修复材料应具备抗菌性。本实验选取牙髓牙周感染常见菌牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌为受试菌株,体外观察复方五倍子对其生长的抑制作用。材料和方法1材料和仪器11材料制备:五倍子冻干粉制备:五倍子原药,敲开除去虫垢及杂质,冲洗清洁干燥,粉碎后过⒛目筛,称取⒛g,加100mL去离子水4℃浸泡娴h,无菌过滤离心,滤液为五倍子水提取物。冷冻干燥后,4℃储存;自芨粉制备:取粒大、色白、饱满的自芨,清水冲洗2遍去除杂质备用。其他材料:BHI培养基,人工唾液。12仪器:SW-CJ1F型净化工作台(苏州净化设备厂);隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂);电子天平;89~s-A型厌氧菌培养罐(沈阳市第五人民医院);立式压力蒸汽灭菌器(江阴滨江医疗设备厂);BHI血琼脂培养基平皿(中国迸出口商品检验技术研究所)。13实验菌种:牙龈卟啉单胞菌ATCC33”⒎具核梭杆菌ATCC586(四川大学华西口腔医学院重点实验室提供)。2方法2.1最小抑菌浓度实验含药培养基的制备:复方五倍子组精密称量五倍子冻干粉和白芨粉各⒛0mg,加用4mL含有5%~10%的脱纤维羊血、5ug/mL氯化血红素、1ug/mL维生素K1的BⅢ培养基,采用二倍稀释法配制浓度分别为100mg/mL,50mg/mL,25mg/mL,12.5mg/mL,⒍25mg/mL,3125mg/mL,⒈56mg/mL,⒍78mg/mL,0.39mg/mL,0.19mg/mL的复方五倍子含药培养基。后晾干,磨粉,过10o目筛,所得干粉C胛照射后4℃冷藏白芨组称取白芨粉⒛0mg,应用上述同样方法配制自芨浓度分别为100mg/mL,50mg/mL,25mg/mL,12.5mg/mL,⒍25mg/mL,3.125mg/mL,⒈56mg/mL,078mg/mL,039mg/mL,019mg/mL的含药培养基。将冻干菌株接种于BHI血琼脂培养基平皿,置厌氧罐内80%N2,10%H2,10%O2)37℃厌氧复苏培养48h,将复苏后的各菌株分别接种于各浓度的含药培养基上,厌氧培养48h后取出,观察细菌生长。22持续抑菌效果实验取无菌大试管3支,分别加入BⅢ无菌培养液8mL,称取五倍子冻干粉、白芨粉各们0mg混匀,在无菌条件下用人工唾液以粉液比2:1的比例调拌成糊剂,并制备成直径6mm、厚3mm的复方五倍子药片,用10层无菌棉纸包裹药片,放入加有8mLBHI培养液的试管内,室温放置,每⒛h吸取1次药物浸出液,再加入BHI培养液8mL,连续120h。另外单独称取白芨粉400mg,按上述相同步骤制成药片并收集药物浸出液。分别取复方五倍子和白芨各时间点药物浸出液1mL,加脱纤维羊血10uL,加1×10’CFU/mL菌液10uL,混匀(每个时间点药物浸出液各3份);另设3支加有1×107CFU/mL菌液10uL,不加药物浸出液的试管作为空自对照。厌氧培养⒉h,取出倍比稀释,取0.1mL涂平板,厌氧培养锶h,菌落计数,取平均值。按照以下公式计算药物对细菌的杀菌率。结果复方五倍子组对本实验所选受试菌株殆、F,l均有抑制作用且具有相同的最小抑菌浓度(MIC)(12.5mg/mL),提示复方五倍子对两种实验菌株均有抑制和杀灭作用,且对这两种受试细菌MIC或MBC浓度一致。白芨组对Pbc、F,l在本实验设置的最大浓度100mg/mL下无抑菌作用。在观察时间内,各实验组均有不同程度的持续抑菌作用。其中,复方五倍子组持续抑菌效果最佳,娴h时达到最大,120h后仍有一定的杀菌作用;白芨组抑菌效果明显低于复方五倍子组,最初杀菌率仅为63%,在%h时抑菌作用已不明显。讨论液体二倍稀释法是美国国立临床实验标准化委员会推荐的三种药物敏感实验方法之一,是细菌药敏试验及抗生素试验研究方面最主要的方法,可用于定量测定抗菌药物抑制微生物生长的能力。中草药敏感度试验的影响因素很多,药物产地,采集时令,炮制方法等均可影响试验结果,不同的试验方法所得结果也不尽相同。就试验方法而言,试管稀释法虽较麻烦,但影响因素少,因此结果较为可靠。髓室底穿孔的治疗是临床上的棘手问题,预后常不理想。影响预后的因素包括穿孔位置、穿孔大小、修补的时机等,而修补穿孔的材料性质则是最关键的影响因素之—。传统的修补材料有氢氧化钙、银汞合金等,直接用于穿孔的充填。但是由于穿孔为"无底洞",这些材料极易通过穿孔处进入牙周组织,造成牙周组织的进一步损伤。内屏障技术是为了防止修补材料进入牙周组织,用生物相容性好且能承受一定压力的材料,置于银汞合金或玻璃离子等修补材料之下以防止超填。这种技术较之传统修复技术有明显的优点,一方面可以压迫止血,隔绝渗出;另一方面可以为封闭材料提供支持面,防止其超充;同时还有抗菌消炎促进组织愈合的作用。硫酸钙、羟基磷灰石、磷酸钙、胶原等材料都曾被用于内屏障材料,但它们各有不足。目前尚无以中药作为内屏障材料的报道。本实验采用自制的复方五倍子作为内屏障材料,观察其抑菌性。牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌是牙周牙髓感染的常见菌㈤,检出率最高,因此本实验以这两种细菌为研究对象,观察复方五倍子对这两种细菌的抑制作用,为进一步研究提供实验依据。已有研究表明,MTA对厌氧菌无抑制作用,钊,银汞合金也无任何抑菌作用囵,而五倍子的抑菌性己有大量实验证实。因此本实验未将三者列入。主要目的是研究复方五倍子制剂对牙周、牙髓感染常见菌是否有作用,并观察其持续的抑菌效果。实验结果显示,复方五倍子对殆、Frl的MIC均为12.5mg/mL,但单独使用白芨在本实验设置的最大浓度100mg/mL时,对绍、‰均无抑制作用,其MIC应大于100mg/mL。提示复方五倍子对受试菌可以起到杀灭和抑制的作用,其主要有效成分应为五倍子。另外,复方五倍子对勹、FIt具有一定的持续抑菌作用,在48h达到最大杀菌率38%,杀菌作用随时间的延长逐渐降低,但到120h后仍有一定杀菌作用。而相同浓度自芨组抑菌效果不显著,最初⒕h的杀菌率仅为6.3%。到96h已无明显抑菌作用。有关白芨抑菌实验的研究报道,白芨对变形链球菌的最小抑菌浓度为125mg/mL。而其对口腔厌氧菌的抑制作用尚未见报道。广东省中小城镇牙本质敏感的流行病学调查来临床口腔医学杂志⒛13午3月第⒛卷第3期JCⅡnstomatol,Mar,⒛13,Vd⒛No3由于五倍子极易溶解于水,白芨粉在复方制剂中主要起到赋形和缓释的作用,为五倍子提供一个载体,这样五倍子可以发挥持续的抑菌作用。以上结果提示,复方五倍子对感染根管内的细菌生长具有一定的抑制作用,并且在一定时间内具有持续的杀菌效果,将其作为内屏障材料,用于髓室底穿孔具有一定的可行性。[参考文献]Chung-Chih Lai,Fu-Mei Huang,You Chan. Antibacterial effect of resinous retrograde root filling materials[J].Journal of Endodontics,2003,(02):118-120.Miyagak DC,Carvalho EMOF,Robazza CRC. In vitro evaluation of the antimicrobial activity of endodontic sealers[J].Braz Oral Res,2006,(04):303-306.陈玉,张晓芳,朱建东. 中药白芨抑制变形链球菌的实验研究[J].牙体牙髓牙周病学杂志,2007,(08):452-454.
