淫羊藿苷对内毒素抑制牙周膜细胞ALP表达的影响

根尖周病变是影响年轻恒牙牙根尖形成的主要因素，其中致病菌革兰氏阴性厌氧菌中的LPS是主要毒力因子。PDLC是具有多种细胞表型的细胞群。LPS对PDLC有明显的细胞毒作用，诱导PDLC表型改变，降低PDLC的ALP活性，抑制其多向分化能力，进而影响根尖周组织再生和修复。淫羊蕾普ICA是淫羊蕾茎叶中提取的黄酮类主要有效成分。已有研究证实淫羊蕾普可以促进成骨细胞增殖，抑制破骨细胞，并可以抑制LPS介导的细胞毒性作用L5}。因此，本实验以PDLC为实验模型，探讨淫羊蕾普对PDLC增殖及ALP表达的影响。材料和方法1.主要试剂和药品抗人波形丝蛋白单克隆抗体(MerckMillipore,USA)，抗人角蛋白单克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)，两步法抗小鼠免疫组化检测试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，脂多糖,ALP试剂盒(南京建成生物工程研究所)，Trizol溶液(LifeTechnologiesCorporation,USA),RTreagentKitWithDNAEraserCTAKARA公司),TaqDNAPolymerise(recombinant)CThermofisherscientific,USA)。淫羊蕾替溶液配制:10mg淫羊蕾普(上海同田生物，纯度)98.0%)加入148p.LDMSO配制成0.1mol/L储存液，-20℃保存。临用前用20mL/L胎牛血清的DMEM培养液将其稀释成不同浓度条件培养液。2方法2.1PDLC分离培养及鉴定选取11-14岁青少年因正畸而拔出的健康前磨牙。PBS液充分冲洗，无菌条件下刮取牙根中1/3牙周膜组织，剪成1mmX1mmX1mm大小，均匀铺在培养瓶底部，加少许20%血清的DMEM培养液，将培养瓶倒置，于细胞培养箱（5%CO2,37℃，700%湿度)孵育2h后翻瓶。每3d换液一次，取第4--6代细胞用于实验。取第3代PDLC培养，玻片10%福尔马林溶液固定，按照两步法免疫组化检测试剂盒使用说明书进行波形丝蛋自、角蛋白染色，光镜下观察。2MTT法检测牙周膜细胞的增殖PDLC以2X10/孔接种于96孔板，待细胞贴壁后，无血清DMEM液同步过夜。不同浓度淫羊蕾普条件培养液培养，每浓度设8复孔，并设置调零孔。96h后，每孔加MrTT溶液20p,L，继续培养4h;弃孔内培养卜清，每孔加入150p,LDMSO，振荡10min，结晶物充分溶解;选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值。选取较佳浓度淫羊蕾普用于步实验。3淫羊蕾普对内毒素作用下牙周膜细胞碱性磷酸酶的影响实验分为:正常对照组(N组)、内毒素组((LPS组10p,g/mL)、淫羊蕾普+内毒素组(ICA10}mol/L+LPS组)3.1RT-PCR检测淫羊霍普对LPS环境下PDLC的ALPmRNA表达影响PDLC以1X105/孔均匀接种于6孔板，分别孵育24h,96h后，按下面步骤检测浮羊霍普对细胞ALPmRN.4表达的影响，实验重复3次。TRIzoI法提取PDLC的总RNAo②按照PrimeScript.RTreagentKitSikhgDNAEraser说明书进行逆转录反应。③以TaqDNAPomerase方法，进行PCR反应，反应产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，凝胶系统分析软件进行半定量分析。④序列:根据GenBank所给出的基因序列，采用PrimerPremier5.0软件设计引物。3.2ALP试剂盒检测淫羊蕾普对hPDLC碱性磷酸酶分泌的影响PDLC以3X104/孔均匀接种于24孔培养板，每组6个复孔。孵育%h后，参照文献[6,收集裂解液。按照.ALP试剂盒说明书测定细胞裂解液中的ALP含量。用BCA法测定细胞裂解液中蛋白质含量。用公式计算:ALP比活性((L/bPro)_测定管光密度/标准管光密度X标准管含酚量/样品中的蛋自克数。4统计学分析采用SPSS13.0统计包对实验资料进行方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义，P<0.01表示差异有统计学显著意义。结果1PDLC原代培养及鉴定原代培养4-10d，镜下可见组织块旁爬出长梭形成纤维样细胞(图1)。传代培养至4代，细胞铺满培养瓶底，密度均匀，呈星形或长梭形，胞质丰满，细胞核为圆形或椭圆形，细胞排列呈旋涡状或放射状(图2)。在细胞来源鉴定中，苏木精一伊红染色可见细胞胞体为长梭形或星形;胞浆红染;胞核嗜碱性，圆形或卵圆形，位于细胞中央，内含3个核仁(图3)。抗波形丝蛋白多克隆抗体染色中胞浆棕染，呈阳性表达(图4)。抗细胞角蛋自染色呈l孙吐(图5)。证实细胞为间叶源，而非上皮源性。2MTT结果淫羊蕾首10-5,10币,10-'Cmol/L)各浓度组与对照组相比均有统计学差异，其中10-5,10-'mol/L组与对照组比较，差异有统计学意义沪<0.05)}10-'mol/L与对照组相比具有显著统计学意义(P<0.07J(表l。3RT-PCR结果RT-PCR结果显示，基因产物单一，引物特异性良好。在24h和%h,V组和LPS组差异均有统计学意义(P<0.01，图6中*表::)。在24h,LPS组和LPS+ICA组差异无统计学意义(P>0.05)。在%h,LPS组和LPS+ICA组差异统训，学意义(P<0.01)(图6)。4ALP活性N组、LPS组及LPS组++ICA组两两比较均有统计学意义。提示10g/mLLPS可显著抑制ALP活性。加入105mol/mL淫羊蕾葺后，对LPS抑制ALP有一定拮抗作用(表2)。讨论未发育完全的年轻恒牙出现根尖病变，经药物诱导根尖孔闭合，Fang经组织学研究发现，根端闭合屏障是由牙本质，骨样牙本质，牙骨质或骨沉积所致，这些组织可由牙周膜结缔组织分化而来。牙周膜主要由PDLC和胶原纤维构成。PDLC是一组具有多向分化潜能的异质性多能干细胞，含有多种细胞成分，具有多种重要的生物学功能。PDLCs可增殖并分化为成骨细胞合成牙周韧带、牙槽骨和牙骨质，从而使根尖周组织得到修复和再生。淫羊蕾，具有"温阳补肾、强筋健骨、祛风除湿”等传统功效。《本草纲目》记载:”牙齿虚痛，仙灵脾为粗末，煎汤频漱，大效。”现代药理学表明，其提取物淫羊蕾普可抑制破骨细胞功能，促进成骨细胞的增殖和分化，并对LPS造成的细胞毒性有抑制作用[5]。王国芳研究发现淫羊蕾普.001,0.01,0.1},g/mL均促PDLC增殖。本实验结果表明，较高浓度淫羊蕾普X10-5mol/L>对PDLC生长有抑制作用;在10}}10-'mol/L范围内呈浓度依赖性促进PDLC增殖,l0}mo1/L作用最强其中淫羊蕾普浓度范围差异可能与药物溶解方式，以及影响体外培养细胞生长状态的因素较多等方面不同有关。ALP作为PDLC的骨向分化重要标志，通过水解磷酸酶、破坏矿化抑制剂以及作为钙结合蛋白和磷酸基转运子而促进矿化。其活性的高低可反应相应细胞向成骨方向转化的趋势,LPS作为革兰氏阴性菌中所独有的一种致病物质，对根尖周组织细胞具有很强的毒性和抗原作用，在根尖周病的发展过程中起着重要作用。LPS对HPDLC细胞毒作用主要表现为:降低HPDLC的ALP活性，使其丧失向成骨样细胞和成牙骨质样细胞分化的潜能。木研究通过酶动力学和RT-PCR共同验证，结果表明，加入10}.},g/mLLPS时，能明显抑制I-IPDLC的ALP活性，此结果与其他学者研究结果一致，提示LPS可抑制HPDLC成骨细胞样特征，诱导HPDLC表型改变，使牙周膜不能进行正常更新和改建，从而影响牙周组织的再生修复功能。加入l0}mol/L淫羊蕾普对LPS抑制ALP活性有拮抗作用，该作用在24h时差异不具有统计学意义，在24h时显著。从而提示适当浓度淫羊蕾营呈时间依赖性阻断LPS抑制ALP活性，促使HPDLC向成骨细胞转化，从而发挥修复再生根尖周组织的作用。但淫羊蕾普促进牙周膜细胞增殖，提高ALP表达的具体机制有待进一步研究。参考文献张笋,葛立宏. 根尖诱导成形术后根尖封闭的种类及影响因素分析[J].现代口腔医学杂志,2007,(04):369-371.Yasuko Yamaji,Takao Kubota,Kenichi Sasaguri. Inflammatory Cytokine Gene Expression in Human Periodontal Ligament Fibroblasts Stimulated with Bacterial Lipopolysaccharides[J].Infection and Immunity,1995.3576-3581.Jun-Jun Fan,Liang-Guo Cao,Tao Wu. The Dose-Effect of Icariin on the proliferation and osteogenic differentiation of human bone mesenchymal stem cells[J].Molecules,2011.10123-10133.李晶晶,于世凤,李铁军. 淫羊藿对口腔各矿化组织破骨细胞性骨吸收的体外实验研究[J].中华口腔医学杂志,2002,(37):391-394.Ke-Wu Zeng,Hong Fu,Geng-Xin Liu. Ieariin attenuates lipop-olysaccharide-induced microglial activation and resultant death of neurons by inhibiting TAK1 / IKK / NF-κB and JNK / p38 MAPK pathways[J].International Journal of Immunopharmacology,2010.668-678.李德华,刘宝林,吴军正. 体外培养的成骨细胞中碱性磷酸酶活性的检测方法探讨[J].实用口腔医学杂志,1997,(01):22-23.Yang SF,Yang ZP,Yang KW. Continuing root formation following apexification treatment[J].Endodontics and Dental Traumatology,1990.232.王国芳,吴织芬,万玲. 淫羊藿苷对牙周膜细胞增殖和骨保护素mRNA表达的影响[J].牙体牙髓牙周病学杂志,2006,(04):223-225.Murakami Y,Kojima T,Nagasawa T. Novel isolation of alkaline phosphatase positive subpopulation from periodontal ligament fibroblasts[J].Journal of Periodontology,2003,(06):780.张凤秋,吴织芬,万玲. 牙周优势菌内毒素对人牙周膜细胞增殖和碱性磷酸酶活性的影响[J].牙体牙髓牙周病学杂志,2003,(01):27-29.