几丁聚糖—犬牙周膜干细胞体外分离培养和鉴定的实验研究

对成体干细胞的研究发现，机体的几乎所有组织中都有成体干细胞。牙周膜是维系牙骨质和牙槽骨的特殊结缔组织，牙周组织具有很强的可塑性，一生都处于不断地改建过程中。牙周膜中的细胞亚群参与了这一过程，其中的未分化间充质细胞具有分化潜力，那么这种细胞是否也象牙髓干细胞一样具有干细胞的特征呢? 2004年，Seo等[1]利用有限稀释法获得人牙周膜细胞克隆，并将该细胞与骨髓基质干细胞和牙髓干细胞做了比较研究。结果发现该细胞具有与上述2种干细胞相似的特性，并将其命名为牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSC）。之后国内外分别有学者对绵羊[2]、人[3-4]的PDLSC进行了分离培养，从多角度对牙周膜干细胞进行了分离培养和体内外鉴定。而有关犬牙周膜干细胞相关研究国内外未见报道。犬是牙周病研究的最常用动物模型，它具有与人的同源性较高、与人的牙周结构相似、便于制作动物模型等优点。本研究以家犬为研究对象，全牙消化法获得犬牙周膜细胞，采用细胞克隆技术获得单细胞来源的牙周膜干细胞克隆，并利用成体干细胞的特性对其进行了初步鉴定，为进一步进行体内研究奠定基础。1  材料和方法1.1  材料与仪器1岁龄雄性杂种家犬4只，体重15 kg±1 kg（第四军医大学实验动物中心提供）。DMEM培养基（Sigma公司，美国），胎牛血清（Gibco公司，美国）、L-谷氨酰胺、青霉素和链霉素、α-MEM（Gibco公司，美国），Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶（Sigma公司，美国），抗波形丝蛋白抗体、抗角蛋白抗体（Dako公司，美国），SABC免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），速眠新（长春农牧大学兽医研究所），抗人Ⅰ型胶原抗体、Ⅲ型胶原抗体，骨涎蛋白抗体（Larry Fisher惠赠），抗STRO-1抗体（Buringame CA公司，美国）。FITC标记的羊抗兔IgG、TRITC标记的羊抗兔IgG（北京中山公司）。二氧化碳恒温孵箱（Forma公司，美国），离心机（Kubota2100公司，日本），YJ-875型超净工作台（北京昌平净化设备厂），倒置相差显微镜及照相系统（Olympas公司，日本），细胞筛网、六孔培养板（Falcon公司，美国）。1.2  犬牙周膜细胞干细胞分离培养1.2.1  细胞原代培养  将1岁龄成年雄性家犬肌注速眠新（0.1 mL/kg）麻醉后，口内、口周聚维酮碘消毒，利多卡因局部麻醉，无菌条件下拔取左下颌3颗下前牙，置入盛有无血清DMEM的培养瓶，封瓶口后立即送往实验室。在超净工作台内用含双抗的PBS自根尖至牙冠反复冲洗，用锐利尖刀片充分刮除牙颈部牙龈组织，含双抗的PBS冲洗后，加入0.25%胶原酶5 mL，置5%CO2、95%的湿度、37 ℃度的孵箱中消化1 h，将液体移入另一离心管，终止消化，1 000 r/min离心6 min；原装牙齿的离心管中重新加入0.25%的胶原酶5 mL，置5%CO2、95%湿度、37 ℃孵箱中消化1 h，再将消化液移入第3支离心管，终止消化，1 000 r/min离心6 min；原盛牙齿的离心管中再重新加入0.25%胶原酶5 mL，置5%的CO2、95%的湿度、37 ℃孵箱中消化1 h，终止消化，1 000 r/min离心。以上每次离心后的沉淀物分别用DMEM（含20%FBS）重悬，在含20%胎牛血清的DMEM培养基中培养，3 d后换液。原代细胞长满培养瓶底后，胰酶消化收集细胞并计数照相。0.15 mL，使每孔0.1 mL细胞悬液中约1个细胞，经过37 ℃、5％CO2培养箱中培养，细胞贴壁后在倒置相差显微镜下观察，挑选含单细胞孔，做标记并补加0.1 mL培养基，待孔中细胞增至占孔底面积1/3~1/2时，用消化法移至48、24、6孔板中扩大培养，扩增单细胞来源细胞至107数量级, 冻存备用并照相。1.3  犬牙周膜干细胞鉴定1.3.1  克隆形成率  将细胞培养于12孔培养板中，待细胞生长至约80％时，加丝裂酶素C（100 mg/L）处理3 h，PBS冲洗数次，DMEM培养基继续培养备用。制备单细胞悬液，按照1 600、800、400、200个孔的密度接种于预铺滋养层细胞的12孔板。3~4 d换液1次，静置培养3~5周后，吸弃培养基，PBS洗3次。甲醛固定15 min，Giemsa染色液染色20~30 min，流水缓慢洗去染色液，空气干燥，进行克隆计数并计算克隆形成率。1.3.2  细胞形态学观察  苏木精-伊红染色观察单细胞克隆来源细胞形态学特征。1.3.3  碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色   制备单细胞来源的细胞爬片，用改良钙钴法进行ALP染色。1.3.4  免疫荧光染色间充质干细胞标志STRO-1表达的鉴定  制备单细胞来源细胞爬片，0.01 mol/L PBS清洗5 min×3次；2.5 mL/L TritonX－100处理15 min；PBS振洗5 min×3次。正常羊血清封闭。一抗滴加1∶150稀释的兔抗人STRO-1抗体，4 ℃湿盒过夜，37 ℃复温1 h，PBS振洗5 min×3次；分别滴加1∶50稀释的FITC标记的羊抗兔二抗，37 ℃孵育1 h，PBS振洗5 min×2次，蒸馏水振洗1次，用500 mL/L无荧光缓冲液甘油封片，阴性对照用PBS代替一抗，其余步骤不变。1.4  犬牙周膜干细胞的分化诱导1.4.1  向成骨/成牙骨质细胞诱导  将传代培养的单克隆来源细胞传代至预先置有盖玻片的24孔培养板，换矿化培养液（15％FCS的DMEM，50 μg/mL维生素C，10 mmol/L地塞米松，10 mmol/L β-磷酸甘油钠）进行培养，诱导1周后进行下一步实验，同时设普通培养基对照，倒置相差显微镜逐日观察细胞形态。待盖玻片上出现肉眼可见的白色结节时，取出盖玻片，PBS清洗，进行Von Kossa钙盐染色。其余细胞爬片采用ABC免疫组化方法进行波形丝蛋白（bone sialapretion，BSP）、Ⅰ型胶原（typeⅠcollagen,Col-Ⅰ）、Ⅲ型胶原（typeⅢ-collagen，Col-Ⅲ）染色。其余细胞用PBS清洗，胰酶消化并加入Trizol1 mL，-20 ℃保存。1.4.2  向神经细胞诱导  细胞来源同上，细胞培养基中加入碱性成纤维生长因子10 μg/L进行预处理24 h，PBS清洗，换培养液并加入3 mmol/L β-羟基乙醇进行诱导，24 h后倒置相差显微镜观察细胞形态，并照相。2  结果2.1  犬牙周膜细胞干细胞分离培养犬原代牙周膜细胞2 h即有贴壁细胞，部分出现集落生长，集落生长细胞呈梭形或多角形，细胞较小，排列紧密；集落边缘细胞呈梭形，细胞大且较长，细胞形态为梭形类似成纤维样细胞（图1）。成功克隆分离获得4株单细胞来源克隆细胞，最终得到扩增。其他部分污染，部分克隆转移后生长缓慢，老化死亡。2.2  犬牙周膜干细胞鉴定平板培养3~5周后，可见明显细胞克隆形成（细胞数大于50），犬牙周膜细胞克隆形成率为0.95％。苏木精-伊红染色观察，细胞形态均一，细胞体积小、核大，有较多的双核细胞。细胞ALP染色呈阳性着色。STRO-1在细胞质中呈较强荧光表达（图2），STRO-1为早期间充质干细胞的标志物，表明牙周膜干细胞为间充质干细胞。2.3  向成骨/成牙骨质细胞诱导的结果矿化诱导的犬牙周膜干细胞免疫组化染色显示：细胞Ⅰ型胶原染色呈强阳性（图3），Ⅲ型胶原染色呈阴性，骨涎蛋白染色呈强阳性（图4）。矿化诱导2周PDLSC形成Von Kossa 染色阳性的矿化结节（图5）。2.4  向神经细胞诱导的结果犬牙周膜干细胞经10 μg/L碱性成纤维生长因子和3 mmol/L β-羟基乙醇诱导24 h后，倒置相差显微镜下观察，部分犬牙周膜干细胞出现不规则突起，状似神经细胞（图6）。3  讨论成体干细胞是指存在于成年机体组织器官中的特异性干细胞，正常情况下处于静息状态，只有少数细胞进行新旧细胞的交替，参与维持组织功能的稳态。当机体组织受损后，这些干细胞组织分化为所在组织类型的细胞，参与组织的修复重建。牙周组织是由牙骨质、牙槽骨和介于二者之间的牙周膜组成，牙周组织一生均处于改建状态，这依赖于PDLSC的不断增殖和分化。由于缺乏其特异性的标识分子，故目前关于PDLSC的分离和鉴定的报道较少。牙周膜干细胞主要利用细胞组织来源为外胚层，通过骨髓间充质干细胞和牙髓干细胞的比较对照，利用间充质干细胞相对特异性标识分子表达和其自我更新方面进行鉴定[2-4]。本实验以家犬为研究对象，利用Seo的方法克隆分离获得牙周膜中的克隆形成细胞，通过干细胞鉴定技术，从形态学、克隆形成率、间充质干细胞特异的STRO-1表达和横向诱导分化等方面对其进行了体外初步鉴定。本实验发现，克隆分离的牙周膜干细胞具有很强的克隆形成能力，克隆形成率为0.95％。传代时发现，贴壁细胞伸展后很快形成一个个单细胞克隆，随着细胞的增殖逐渐融合。细胞形态为成纤维样细胞，胞体体积小，核大，有一个或几个核仁。成体干细胞的增殖特点是以克隆形成能力较强为主，这与干细胞在体内的生存环境有关。成体干细胞是组织中的储备细胞，在正常情况下，成体干细胞不活跃，当机体组织继续生长或受到损伤后，成体干细胞被激活并参与组织的修复过程，在这个过程中，成体干细胞分化增殖，从较少量的细胞快速增殖形成组织所需的细胞量。本研究获得的结果，在克隆形成能力方面与Seo研究结果相似。干细胞ALP染色强阳性，而已分化的干细胞ALP呈弱阳性或阴性，因此ALP常作为鉴定干细胞或干细胞分化与否的标志之一[5]。由于目前尚无PDLSC特异的表面标志物，因此本实验利用ALP来鉴定其分化状态，结果表明，克隆分离的牙周膜来源细胞ALP染色阳性，证明其具有未分化干细胞的某些特征。STRO-1被认为是早期间充质干细胞的表面标志物，成体干细胞生存在特殊的微环境中，微环境中的信号分子调控干细胞维持在正常功能状态，STRO-1阳性为来源于前血管微环境中干细胞的特征性标志[6－8]，常被用来鉴定骨髓间充质干细胞和牙髓干细胞。本研究克隆分离的牙周膜干细胞表达STRO-1，具有与其他间充质干细胞相似的特性，提示牙周膜干细胞可能来源于前血管细胞[9-11]。干细胞具有不对称分裂的特性，具有向终末组织分化的能力。牙周组织是机体中较为特殊的组织，由牙骨质、牙槽骨2种硬组织和牙周膜共同组成，其功能细胞（成牙骨质细胞和成骨细胞）均由牙周膜中的前体细胞分化而来，此2种硬组织形成细胞具有分泌基质形成牙骨质、牙槽骨的功能。本研究观察到，牙周膜干细胞经过适当的诱导后，可以形成矿化结节，具有一定矿化能力，细胞表达成骨细胞特异的骨涎蛋白，细胞Ⅲ型胶原表达减弱。Ⅲ型胶原是牙周膜组织中的有机成分，在正常成体牙周组织中，牙周膜表达Ⅲ型胶原而牙骨质、牙本质和牙槽骨不表达。本研究经矿化诱导后细胞不表达Ⅲ型胶原。骨涎蛋白是成骨细胞的特异性标志物，而在牙周膜细胞中不表达。本研究诱导后的细胞表达骨涎蛋白和不表达Ⅲ型胶原，而Ⅰ型胶原为强阳性着色，证实细胞已向成骨/成牙骨质细胞分化，而细胞究竟分化成成骨细胞，还是成牙骨质细胞有待进一步证实。为了从可塑性方面观察牙周干细胞的特性，本研究采用间充质干细胞鉴定技术，用含碱性成纤维生长及β-羟基乙醇的诱导液对其诱导，结果发现细胞形态由梭形变为多突起的细胞，状似神经细胞，表明此细胞具有向神经细胞分化的特性。而神经细胞非牙周组织细胞，由此可知牙周膜干细胞具有横向分化的特性。对牙髓干细胞的研究表明，牙髓干细胞具有向神经细胞分化的特性，表达神经细胞特有的神经巢蛋白[12]，而牙周膜具有丰富的感觉和营养功能，牙周膜细胞可分泌多种神经营养因子[13-14]。本研究观察结果也提示，牙周膜干细胞在特定的条件下可横向分化为神经细胞。目前对成体干细胞的定义尚有争论，较为统一的观点为具有集落形成、自我更新和多向分化潜能等特性。本研究取材于家犬前牙的牙周膜，利用有限稀释法分离获得PDLSC，观察其克隆形成能力、ALP染色和间充质干细胞的相对特异性标志物STRO-1染色，并利用干细胞向终末组织的分化特性和其横向分化特性对其进行了体外初步鉴定。矿化诱导后的细胞是否具有成牙骨质细胞的表型，神经方向诱导后只是从形态学上进行了观察，是否诱导后的细胞表达神经细胞特异神经巢蛋白和神经胶质酸性蛋白还有待进一步研究。

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