长期海上航行官兵口腔颊黏膜细菌学变化研究

　　近年来，人类微生物组对人体各种微生物极其基因进行研究，阐明了微生物在人类健康和疾病中的作用，为疾病的预防、诊断和治疗提供帮助[1-2].口腔正常菌群的各种微生物之间除能相互制约外，还能阻止或干扰其他病原体的定植，对机体提供一定的保护作用[3].本研究探讨长期海上航行舰艇官兵口腔细菌的变化特点，为提高长期海上航行官兵的卫勤保障提供依据。　　1材料与方法　　1.1一般资料采样对象为长期海上航行舰员，其中，医疗组30人，机电组25人；任务前期采样55份，任务中期采样55份，任务后期采样54份，共采集标本164份。　　1.2仪器与试剂　　（1）口腔黏膜采样及运送系统，包括92mm×16mm细菌采样管（内含脑心浸出液肉汤3mL）和采样拭子（编号：MT0101），由北京友康基业生物科技有限公司生产。　　（2）培养基，血琼脂平板（编号：PB0115A,Oxoid公司），用于一般细菌的分离培养；中国蓝琼脂平板（编号：PO5060A,Oxoid公司），主要用于革兰阴性杆菌的分离培养；巧克力琼脂平板（编号：PB0136A,Oxoid公司），主要用于嗜血杆菌和奈瑟菌的分离培养；沙保罗琼脂平板（编号：PO0160A,Oxoid公司），主要用于真菌的分离培养。（3）基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（BrukermicroflexTMMALDI-TOF-MSBioTyperTM），由德国布鲁克公司生产。　　1.3细菌质控菌株大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853和金黄色葡萄球菌ATCC25923,由中国药品生物制品检定所提供。　　1.4方法　　1.4.1标本采集用采样拭子在口腔颊黏膜进行涂抹，放入细菌采样管中，对于不能立即培养的标本放-20℃冰箱保存。　　1.4.2细菌培养与分离将口腔颊黏膜细菌标本（如果是冻存标本，先室温解冻，再置于35℃培养箱培养6h）分别接种血琼脂平板、中国蓝琼脂平板、巧克力琼脂平板和沙保罗琼脂平板，放35℃培养箱培养24~48h,根据细菌在不同培养基上的生长情况和菌落的不同特征进行细菌分纯，得到纯培养细菌。　　1.4.3细菌鉴定取血琼脂平板、中国蓝琼脂平板、巧克力琼脂平板和沙保罗琼脂平板上的纯培养细菌进行手工及质谱仪鉴定。手工鉴定先进行革兰染色，镜下观察，根据染色结果选做触酶、氧化酶、DNA酶、动力和氧化发酵试验进行初步分科，再按科内各菌属的鉴别方法鉴定到种。质谱仪鉴定微生物处理方法：培养单菌落后分离灭活，将菌体蛋白溶于50μL70%甲酸（FA）和50μL乙腈（ACN）中，充分混匀，高速离心后吸取上清液上质谱仪鉴定。　　1.5统计学处理采用SPSS13.0软件进行统计学分析，计数资料以率表示，采用χ2检验，以犘<0.05为差异有统计学意义。　　2结果　　2.1任务前、中、后期口腔颊黏膜病原菌分布164份口腔颊黏膜标本分离出病原菌18种64株，结果见表1.口腔颊黏膜分离出的主要病原菌有金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌，3种细菌的分离率分别为31.3%、17.2%和9.4%.其中金黄色葡萄球菌质谱图见图1（见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”）。　　2.2任务前、中、后期口腔颊黏膜栖居菌分布164份口腔颊黏膜标本分离出栖居菌18种339株，结果见表2.主要栖居菌有卡他布兰汉菌、口腔链球菌和表皮葡萄球菌，3种栖居菌的分离率分别为43.9%、40.1%和7.4%.其中表皮葡萄球菌质谱图见图2（见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”）。　　2.3任务前、中、后期医疗组与机电组口腔颊黏膜细菌数量变化医疗组与机电组比较，在任务中、后期病原菌检出率之间差异有统计学意义（犘<0.05），栖居菌数检出率之间差异无统计学意义（犘>0.05）。　　3讨论　　在正常状态下，口腔黏膜可形成一种保护性屏障，阻止病原微生物入侵。机体与口腔微生物之间保持一种动态平衡，为维护人体健康发挥重要的作用，如果这种生理平衡被打破，则非致病微生物可转化成条件致病微生物，导致各种感染的发生。人类口腔微生物组数据库的建立为人们了解、认识复杂的口腔微生物环境提供了一个崭新的平台，为各种口腔疾病的防治奠定了坚实的基础[1-5].健康人体的口腔包含上百种不同的细菌、病毒和真菌等微生物。口腔中的大部分细菌是兼性厌氧菌，少部分是需氧和厌氧菌。大多数口腔微生物还不能用常规方法培养出来。在不同宿主的口腔中，用常规培养方法检出微生物的差别很大，通常有0~7种微生物被检出。现代生物技术以DNA为基础的一系列研究方法，如16SrRNA基因技术、高通量指纹技术、宏基因组学技术及下一代测序技术，使人类可以在结构复杂性和基因多态性的意义下更清晰地研究和了解人体口腔微生物菌群[3-4].口腔细菌的鉴定方法有多种，如传统手工法、细菌鉴定仪及质谱仪等方法。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪是一种能够快速对致病微生物进行精确到种的全自动快速鉴定系统。该系统采用检测微生物的蛋白质指纹谱图，通过专用软件对这些指纹谱图进行处理并与专用的微生物数据库中各种已知微生物的标准指纹图谱进行比对，从而完成对微生物的鉴定。质谱技术具有大规模、高通量的特点，可对传染病原体进行快速筛查、鉴定与预警[6-8].对长期海上航行官兵口腔颊黏膜标本的研究发现，远洋航行期间，由于多种原因导致机体抵抗力降低，口腔正常菌群的平衡被打破，使病原菌（如黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌）数量增加，栖居菌（如口腔链球菌）数量减少。机电组在任务中、后期病原菌种类增加，由于机电官兵工作时间长，劳动强度大，工作环境差，机舱内高温、高湿、噪音大、有害气体多，对机体影响大，口腔细菌变化明显。王峰等[9]报道，长期海上航行官兵龋齿、牙周疾病和口腔溃疡的发病率分别为22.7%、80.9%和25.2%.扈祚文等[10]报道，长期海上航行官兵牙周疾病的发病率，出海前为78.0%,出海后达到90.9%.研究表明，长时间海上航行，由于环境恶劣、任务繁重、精神紧张、食物供应单调、缺少新鲜蔬菜水果，舰员饮食含脂肪和糖摄入比重偏重，无机盐和维生素摄入不足，易发生长期海上航行疲劳，可导致机体免疫功能下降，口腔菌群失调，引发口腔疾病[11].　　参考文献　　[1]1diversityofthehealthyhumanmicrobiome[J].Nature,2012,486（742）：207-214.　　[2]TheHumanMicrobiomeProjectConsortium.Aframeworkforhumanmicrobiomeresearch[J].Nature,2012,486（2）：215-221.　　[3]亓庆国。口腔微生物学[M].济南：山东大学出版社，2011:1-157.　　[4]薛晶，肖丽英，周学东。人体口腔微生物组研究最新进展[J].华西口腔医学杂志，2010,28（1）：5-8.　　[5]耿雪，王岚，刘新，等。牙周疾病对系统性疾病发展的影响[J].沈阳医学院学报，2011,13（1）：57-60.　　[6]叶应妩，王毓三，中华人民共和国卫生部医政司。全国临床检验操作规程[M].2版。南京：东南大学出版社，1997:474-526.　　[7]俞树荣。微生物学和微生物学检验[M].2版。北京：人民卫生出版社，1997:143-294.　　[8]鲁辛辛，袁梁。新技术在微生物检验中的应用[J].中华检验医学杂志，2009,32（5）：596-600.　　[9]王峰，刘世森。某舰护航官兵口腔健康状况调查分析[J].海军总医院学报，2011,24（1）：19-20.　　[10]扈祚文，钟文，董振海。长时间远航舰船官兵牙周病状况调查[J].海军医学杂志，2011,32（3）：145-146.　　[11]曾葭，黄志强，宫峰，等。长期海上航行舰艇人员常见病的防治[J].海军医学杂志，2012,33（1）：4-6.　　（收稿日期：2014-02-18）