超速起搏预适应的延迟保护与热休克蛋白27的表达

　　作者：吴立春1,陈国桢2,方中良1　　作者单位：1.岳阳市第二人民医院ICU科，湖南，岳阳　414000;2.福建医科大学附属第二医院心内科

　　【摘要】目的：观察超速心室起搏(VOP)预适应延迟保护阶段热休克蛋白27(HSP27)的表达水平。方法：新西兰兔24只，随机分为3组，缺血再灌注(I/R)空白对照组，起搏组，起搏+放线菌素D组。制作I/R和超速起搏预适应的动物模型，检测肌酸激酶(CK)和肌酸激酶-同工酶(CK-MB)水平的变化，动态描记再灌注时心电图，以免疫组织化染色法检测HSP27抗原表达水平。结果：I/R后起搏组心肌酶的水平均明显低于I/R空白对照组和起搏+放线菌素D组(P<0.01);I/R空白对照组在再灌注过程中共有5只(62.5%)发生心律失常，起搏+放线菌素D组有4只(50.0%)，而起搏组无心律失常发生。起搏组心律失常发生率明显低于I/R空白对照组和起搏+放线菌素D组(P<0.05)。起搏组HSP27阳性表达++者(37.5%)明显高于I/R空白对照组和起搏+放线菌素D组(0,12.5%，P<0.05)。结论：心室超速起搏预适应有心脏保护作用，其机制可能与热休克蛋白27表达增加密切相关。

　　【关键词】 心肌再灌注,心脏起搏,人工,热休克蛋白27

　　Abstract：Objective：To observe delayed cardioprotection effect induced by preconditioning from ventricular overdrive pacing(VOP) and expression level of heat shock protein 27 (HSP27) in phase of ischemia-reperfusion(I/R). Methods：A total of 24 New Zealand rabbits were randomly divided into I/R blank control group，pacing group and pacing + actinomycin D group. Animal models of I/R and VOP preconditioning were established. Changes of levels of creatine kinase (CK) and creatine kinase isoenzyme (CK-MB) were measured，electrocardiogram was recorded during I/R. Immunohistochemical staining was used to detect HSP27 . Results：During I/R，levels of CK and CK-MB in I/R pacing group were significantly lower than those of I/R blank control group and pacing + actinomycin D group (P<0.01 all);during I/R，there were 5(62.5%) and 4(50.0%) rabbits occurring arrhythmias in I/R blank control group and pacing + actinomycin D group respectively，and no arrhythmia occurred in pacing group. Incidence rate of arrhythmia in pacing group was significantly lower than those of other two groups (P<0.05).Cases with HSP27 positive expression++in I/R pacing group (37.5%)was significantly higher than those of I/R blank control group and pacing + actinomycin D (0,12.5%，P<0.05 all). Conclusion：Preconditioning from overdrive ventricular pacing possesses cardioprotection effect，and its mechanism may be close correlation with increased expression of heat shock protein 27.

　　Key words：Myocardial reperfusion;Cardiac pacing，artificial;Heat-shock proteins 27

　　Murry于1986年首先提出了缺血预适应(ischemic preconditioning，IPC)的概念，近20年来对其保护作用机制进行了大量的研究。热休克蛋白(heat shock protein，HSP)是机体应激时产生的高度保守的一类保护性多肽，最近几年小分子的HSP的保护作用广受关注。HSP27在预适应的保护作用机制中起着重要的作用，但其确切机制尚不完全清楚，特别是HSP27与延迟保护作用的关系，国内外报道较少。本实验通过建立兔超速起搏预适应和缺血再灌注的动物模型，检测延迟保护阶段HSP27的表达情况，初步探讨预适应延迟保护作用和HSP27的关系，为临床保护心肌提供理论基础和实验依据。

　　1　资料与方法

　　1.1　材料

　　健康的新西兰雄兔24只，由上海动物实验中心提供(动物合格证号：0013964)，体重约2.2～2.8，(2.5±0.2)kg。DF-5A心脏电生理刺激仪(苏州工业园区东方电子仪器厂);XD-7300心电图机(上海医疗器械技术公司);小动物呼吸机(浙江大学医学仪器厂);放线菌素D(浙江海正药业股份有限公司);HSP27抗体及免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

　　1.2　模型的建立

　　24只兔随机分成3组，缺血再灌注(I/R)空白对照组、起搏组、起搏+放线菌素D组，每组8只。戊巴比妥钠麻醉，分离右侧颈静脉并插血管鞘管，5F起搏电极经血管鞘管插入，送入右心室。① 空白对照组：置管70 min后取出。结扎右颈静脉，80万U青霉素钠局部抗感染，缝合皮肤后放回动物室继续饲养;②起搏组：同I/R空白对照组置管后，以500 次/min起搏右心室10 min×4次 (间歇5 min)，此后同I/R空白对照组;③起搏+放线菌素D组：动物麻醉后静脉注射放线菌素D 0.1mg/kg，余同起搏组。

　　24 h后各组重新麻醉，气管切开，接小动物呼吸机。沿胸骨左缘剪断胸骨左缘2、3、4肋，剪开心包，暴露心脏，在冠状动脉前降支中上1/3处，用4.0丝线穿过浅层心肌，其末端套一外径为2 mm的聚氯乙烯管，通过拉紧丝线以阻断冠脉血流，用动脉夹挤压聚乙烯管，此时心脏表面出现青紫。造成心肌缺血(ST段抬高超过0.5mm，缺血区域心肌颜色变为灰暗表示有效)，松开丝线即可恢复灌流，于再灌注0 min，再灌注30 min，再灌注60 min时观察有无心律失常，若无心律失常，用临时起搏电极靠近心室表面刺激10 s，观察有无诱发心律失常，并连续记录心律失常情况。

　　1.3　标本的采集和处理

　　(1)分别于结扎前10 min，再灌注0 min，再灌注30 min，再灌注60 min时抽血，用生化自动分析仪测定血浆中血清肌酸磷酸激酶 (CK)和肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)的含量;(2)再灌注60 min后立即处死，分别取出左室结扎线上、下的心肌组织，免疫组化检测HSP27抗原，严格按免疫组化试剂盒说明书的步骤进行。免疫组织化学染色结果判定，参考引文[1]的判定方法，将HSP27染色程度分为4个层次，包括“-”，“+”，“++”，“+++”。

　　1.4　统计分析方法

　　应用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差(x-±s)表示，均数间的比较采用重复测量的两因素多水平分析法;计数资料以率表示，率的比较采用Fisher确切概率法;等级资料比较采用多个独立样本比较的Kruskal-Wallis H检验法，P<0.05为差异有显著性。

　　2　结　果

　　2.1　血清心肌酶的变化

　　缺血前三组的血清CK和CK-MB水平比较无显著差异;而在再灌注不同时相三组血清CK和CK-MB水平较缺血前明显升高，且随时间变化有逐渐升高的趋势(趋势检验P<0.01)，以I/R空白对照组升高最多，起搏组上升最小，起搏+放线菌素D组介于二者中间，三组间的比较均有显著性差异(P<0.01)，见表1。表1　三组兔缺血再灌注前后血清CK和CK-MB水平的变化

　　2.2　三组兔心律失常发生率的比较

　　起搏组无心律失常发生，而I/R空白对照组和起搏+放线菌素D组均自发或经刺激后可诱发出现心律失常，包括频发早搏、室性心动过速、房室传导阻滞、室颤，心律失常发生率分别为62.5%,50%，均显著高于I/R空白对照组(P<0.05)。

　　2.3　HSP27的表达结果

　　光镜下，HSP27阳性表达的切片中细胞核和细胞浆均着色，呈成片表达，呈棕褐色反应，高倍镜下可见细胞核和细胞浆成片的棕褐色颗粒。结扎线上和结扎线下阳性程度比较无显著差异(P>0.05)。起搏组中HSP27大量表达，而I/R空白对照组和起搏+放线菌素D组中只有少量表达(图1A,1B，见封四)，起搏组的表达显著多于另两组(P<0.05)，见表2。表2　三组实验兔心肌组织结扎线上、下热休克蛋白表达阳性染色程度的比较

　　3　讨　论

　　HSP27属于小分子量的热休克蛋白基因家族，除具有分子伴侣作用外，还有抗氧化损伤和抗细胞凋亡作用[2]。HSP27是p38丝分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)级联反应的磷酸化底物，心脏体外实验和细胞培养实验显示[3,4]p38MAPK引起的HSP27的持续磷酸化与预适应的早期保护作用密切相关。Sakamoto K等发现[5]，离体心脏I/R预处理后，主要变化是磷酸化的HSP27从胞质溶胶重新分布至肌小节，HSP27的量无明显变化。而最近研究显示[6]，新生鼠的心室肌细胞经热休克处理后24 h，HSP70和HSP27表达都增加，保护细胞免受损伤。国内学者张雪松等[7]也发现细胞经缺氧预处理后48 h，HSP27基因表达增加，对心肌细胞的保护作用可能与HSP27的抗细胞凋亡作用有关。

　　本实验采用超速起搏预适应的方法研究预适应的保护机制，观察到了它有抗心肌坏死和减少心律失常的保护作用。这与大多数研究显示快速起搏心室可以模拟缺血预适应结果一致。本实验根据CK和CK-MB水平估测心肌坏死程度，结果显示起搏组心肌坏死程度最轻，可能与HSP27抗氧化损伤和抗细胞凋亡作用有关。这与刘莉等[2]报道的转基因细胞实验结果相符。另外，本实验观察到超速起搏预适应后24h，结扎线上、下心肌广泛地表达HSP27，由此可知其表达与持续缺血无明显关系，而可能与超速起搏心室诱导其表达增加有关。这与国内外细胞体外实验[6,7]结果一致。

　　本实验说明HSP27表达对缺血心肌的保护作用。实验是有一组是起搏+放线菌素D组。放线菌素D为细胞周期非特异性药，能抑制RNA的合成，干扰细胞的转录过程，可抑制HSP27的表达。本实验结果显示在I/R时起搏+放线菌素D组HSP27表达较少，说明放线菌素D有抑制HSP27表达的作用。

　　总之，结合国内外研究以及本实验结果，HSP27在预适应的保护机制中起着重要的作用，早期保护作用主要与HSP27磷酸化和再分布有关，而延迟保护作用可能与HSP27表达增加有关。对其确切机制还需做进一步的研究。

　　【参考文献】

　　[1]李志高，李晓冬，董新舒，等.大肠癌组织RAB5A和CD44v9表达的意义[J].世界华人消化杂志，2006,14 (9)：848-852.

　　[2]刘　莉，张小进，姜苏蓉，等.人心肌热休克蛋白27基因克隆及其高表达对大鼠心肌细胞氧化损伤的保护作用[J].中华老年医学杂志，2004,23 (12)：879-882.

　　[3]Marais E，Genade S，Salie R，et al.The temporal relationship between p38 MAPK and HSP27 activation in ischaemic and pharmacological preconditioning[J].Basic Res Cardiol,2005,100(1)：35-47.

　　[4]Armstrong SC，Delacey M，Ganote CE.Phosphorylation state of hsp27 and p38 MAPK during preconditioning and protein phosphatase inhibitor protection of rabbit cardiomyocytes[J]. J Mol Cell Cardiol,1999,31(3)：555-567.

　　[5]Sakamoto K，Urushidani T，Nagao T.Translocation of HSP27 to sarcomere induced by ischemic preconditioning in Isolated rat hearts[J].Biochem Biophys Res Commun,2000,269(1)：137-142.

　　[6]Wei H，Campbell W，Vander Heide RS.Heat shock-induced cardioprotection activates cytoskeletal-based cell survival pathways[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2006,291(2)：H638-H647.

　　[7]张雪松，张雪岩，杨秀娟，等.HSP27在大鼠心肌细胞缺氧预处理中的保护作用及其机制[J].中国康复理论与实践，2006,12(4)：301-303.