黄芩苷对人牙周膜细胞RANKL OPG表达的影响及其作用

　　作者：陈悦1,吴织芬2,杨连甲3　　作者单位：1. 西安交通大学医学院口腔医院牙周黏膜科，陕西西安 710004;2. 第四军医大学口腔医学院牙周黏膜病科;3. 第四军医大学口腔医学院组织病理科，陕西西安 710032

　　【摘要】 目的 研究黄芩苷对人牙周膜细胞核因子κB受体激活物配基和骨保护素(RANKLOPG)表达的影响及其作用机制。方法 首先构建转化生长因子βⅡ型受体(TGFβⅡR)靶向siRNA真核表达载体，转染正常人外周血T细胞，使T细胞表面的TGFβⅡR基因沉默，继而将转染与未转染靶向性TGFβⅡR基因沉默的T细胞和正常人牙周膜成纤维细胞置于加有黄芩苷和内毒素的培养基中，分为6组：①正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+转染siRNA1的T细胞+黄芩苷;②正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+转染siRNA1的T细胞;③正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+正常T细胞+黄芩苷;④正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+正常T细胞;⑤正常牙周膜成纤维细胞+黄芩苷;⑥正常牙周膜成纤维细胞。共培养48h，RTPCR检测牙周膜细胞RANKL和OPG的表达，计算RANKL/OPG比值。结果 ①酶切鉴定正确的克隆测序结果与设计的目的序列完全一致;②转染siRNA1的T细胞组的TGFβⅡR mRNA的表达被明显抑制;③RANKL/OPG的比值在各组间的差异有统计学意义(P<0.01)。结论 成功构建了TGFβⅡR靶向siRNA真核表达载体并成功转染T细胞;黄芩苷可以降低牙周膜细胞表面RANKL/OPG比值;TGFβ的信号传导在黄芩苷影响牙周膜成纤维细胞表面的RANKL/OPG表达过程中起着重要作用;黄芩苷并非只通过TGFβ信号传导通路，而是亦通过其他通路对牙周膜成纤维细胞表面的RANKL/OPG进行调控。

　　【关键词】 转化生长因子βⅡ型受体;小干扰RNA;核因子κB受体激活物配基;骨保护素;牙周膜成纤维细胞

　　Effect of baicalin on the expression of receptor activator of nuclear factorκB

　　ligand and osteoprotegerin in human periodontal ligament cellsCHEN Yue1, WU Zhifen2, YANG Lianjia3

　　(1. Department of Percodontology and Oral Medicine, Oral Hospital, Medical School of

　　Xian Jiaotong University, Xian 710004; 2. Department of Periodontology and Oral Medicine,

　　School of Stomatology, Fourth Military Medical University; 3. Department of Oral Histopathology,

　　School of Stomatology, Fourth Military Medical University, Xian 710032, China)ABSTRACT: Objective To study the effect of baicalin on the expression of receptor activator of nuclear factorκB ligand (RANKL) and osteoprotegerin (OPG) in cultured human periodontal ligament cells (HPDL cells) as well as its action mechanism. Methods We first constructed small interferring RNA (siRNA) eukaryotic expression vector targeted transforming growth factor βⅡ receptor (TGFβRⅡ), and then transfected it into T cells. Then HPDL cells together with T cells transfected with siRNA or not were placed in medium that had been added with lipopolysaccharide (LPS) and baicalin. They were divided into six groups and cultured for 48 hours. Reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RTPCR) was used to observe the effect of baicalin on OPGRANKL expression in HPDL cells. Results The clone sequence correctly identified by RTPCR was consistent with the designed target sequence. The recombinant vector was constructed successfully and the expression of TGFβⅡR of T cells which had been transfected with siRNA1 was inhibited obviously. Ratio of RANKL/OPG in each group differed significantly (P<0.01). Conclusion ① siRNA eukaryotic expression vector of recombinant targeting gene TGFβⅡR has been constructed and it has been transfected T cells successfully; ② Baicalin can reduce the ratio of RANKL/OPG on PDL cells; ③ TGFβ signaling transduction plays an important role in the effect of baicalin on RANKL/OPG ratio on PDL cells; ④ Baicalin acts not only through TGF β to regulate RANKL/OPG in PDL cells, but also through other pathways.

　　KEY WORDS: transforming growth factor βⅡ receptor (TGFβRⅡ); small interfering RNA(siRNA); receptor activator of nuclear factorκB ligand (RANKL); osteoprotegerin (OPG); periodontal ligament cells (PDLC)

　　骨保护素(osteoprotegerin, OPG)及其配体核因子κB受体激活物配基(receptor activator of nuclear factorκB ligand, RANKL)是调控破骨细胞生成和活化的关键因子，在调节骨质吸收中发挥着重要作用。研究发现OPGRANKL能在人牙周膜成纤维细胞(periodontal ligament cell, PDLC)表达，并受多种因素调节[13]。在口腔局部微环境中,众多因素通过作用于牙周组织，使OPG与RANKL的浓度增加或减少来调控局部骨组织代谢。

　　细菌激发的诉诸免疫炎症反应是造成和影响牙周组织破坏的主要原因。黄芩苷的抗炎作用则决定了其在牙周病的防治中可能起到重要作用。有研究证实，黄芩苷、淫羊霍苷和大黄素组合时可抑制内毒素(LPS)刺激下人牙龈成纤维细胞中前列腺素E2(PGE2)的产生，亦可抑制实验性牙周炎牙槽骨吸收[4]。本研究的第一个目的，即拟通过观察黄芩苷对PDLC上OPGRANKL表达的影响，从而证实黄芩苷对牙槽骨的吸收的调节作用。

　　牙周炎时，T细胞的数量、活性增高，导致炎症细胞因子分泌增加，加重牙周炎症和骨吸收。转化生长因子β(transforming growth factor β, TGFβ)可以抑制T细胞的活性和增殖[56]。黄芩苷抗炎作用的机制也与抑制白介素1(IL1)、肿瘤坏死因子α(TNFα)等炎性因子的过度产生有关[78]，因而设想黄芩苷的抗炎抗骨吸收作用可能是通过TGFβ实现的。本研究的第二个目的，即黄芩苷是否通过增强TGFβ对T细胞的抑制作用，引起T细胞活性降低、数量减少，导致T细胞在内毒素作用下分泌TNFα等炎症因子减少，继而影响OPGRANKL，降低破骨细胞形成，从而减少骨丢失。

　　为达到以上两个研究目的，本实验首先构建了靶向转化生长因子βⅡ型受体(transforming growth factor βⅡreceptor, TGFβⅡR)的小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)真核表达载体，并将其转染T细胞，随后将正常PDLC与转染或未转染siRNA的T细胞置于加有内毒素和黄芩苷的培养液中，观察黄芩苷对正常PDLC上OPGRANKL表达的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 TGFβⅡR靶向siRNA真核表达载体的构建 根据GenBank中报道的TGFβⅡR核苷酸序列，参考siRNA的设计原则，按照pSilencer3.1H1载体的设计要求，设计2条siRNA序列。TGFβⅡR siRNA转录模板由北京华大公司合成，RNAi TGFβⅡR目标序列依次为：5′GATCCGCAGCAT

　　GTGTATAGCTGAATTCAAGAGATTCAGCTA

　　TACACATGCTGCTTTTTTGGAAA3′和5′GA

　　TCCGCCAGCCATTGCTCATAGATTCAAGAG

　　ATCTATGAGCAATGGCTGGCTTTTTTGGAA

　　A3′，分别命名为siRNA1和siRNA2。两个片段直接与经BamHⅠ和HindⅢ酶切的pSilencer3.1H1载体连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，摇菌培养后提取质粒，送北京华大公司进行序列测定。将测序正确的克隆分别命名为siRNA1和siRNA2。

　　1.2 T细胞的分离培养 取正常健康志愿者外周血5mL于肝素抗凝管中，加入RosetteSep人T细胞富集抗体混合液(50mL/L全血)，充分混匀,室温静置30min，以等倍体积PBS稀释，充分混匀后小心加到淋巴分离液上，以20℃、2000r/min离心20min，取中间单核细胞层，用PBS液洗两次(4℃、1500r/min 15min)，然后用RPMI1640完全培养液调整细胞数为2×109～4×109/L。

　　1.3 潮霉素筛选浓度的确定 于6孔板中，接种T细胞3.0×105/孔，加含100mL/L FBS的DMEM培养基2mL，分别加入50g/L的潮霉素2、4、6、8、10、12μL，潮霉素终末质量浓度依次为50、100、150、200、250、300mg/L，37℃培养。每3d换液1次。显微镜下观察细胞的生长状况，以第8天能杀死孔内所有T细胞的潮霉素浓度确定为筛选浓度。

　　1.4 脂质体介导的T细胞的稳定转染 转染前24h，在6孔板内按1×106细胞/孔接种细胞，转染方法按试剂说明书进行。3周后将稳定生长的细胞克隆逐次转移至24孔板、6孔板和培养瓶中扩大培养，获得整合有pSilencer3.1H1重组质粒并能稳定表达siRNA1和siRNA2的单克隆细胞株。

　　1.5 细胞生长曲线的绘制 将已转染了siRNA1和siRNA2的单克隆细胞株制备单细胞悬液，接种96孔板，设5个复孔，37℃、50mL/L CO2条件下培养。设正常人T细胞作为对照组。1、2、3、4、5、6、7d时，弃液，每孔加入20μL 5mg/mL的MTT，继续培养4h后弃液，每孔加入150μL DMSO，震荡10min溶解结晶，用酶联免疫检测仪测定各孔490nm的吸光度值。以培养时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

　　1.6 RTPCR检测TGFβⅡR的表达 根据人TGFβⅡR的基因序列，用Primer Premier 5.0软件设计了扩增TGFβⅡR的RTPCR引物P1和P2，以βactin作为内参照。引物由上海Sangon公司合成。βactin：5′CTGGGGCGCCCCAGGCACCA 3′，5′ C

　　TCCTTAATGTCACGCACGATTTC 3′，520bp，退火温度52℃;TGFβⅡR：5′ TTTCCACCTGTGAC

　　AACC 3′，5′ TGACAGATATGGCAACTC 3′，346bp，退火温度55℃。按照TRIZOL说明书提取细胞总RNA。按照RTPCR试剂盒说明书,将mRNA逆转录为cDNA,再将所得的cDNA进行PCR扩增。取5μL PCR反应产物，经过15g/L琼脂糖凝胶电泳后,在紫外投射反射仪下观察结果。采用DNA MarkerⅠ作为DNA长度标志。通过凝胶图像成像分析系统,以目的基因的PCR扩增片段灰度与相应的内参βactin扩增片段灰度的比值作为其mRNA表达水平的相对参数。

　　1.7 Western blot检测TGFβⅡR的表达 选取一抗为兔抗人TGFβⅡR多抗，二抗为生物素化山羊抗兔IgG。严格按照ECL Western blot试剂盒说明书步骤操作。

　　1.8 人牙周膜细胞的分离培养 选取11～14岁青少年因正畸而拔除的前磨牙，用PBS液反复冲洗，无菌条件下刮取牙根中1/3的牙周膜组织，剪碎后用2.0×105u/L Ⅰ型胶原酶37℃消化1h，800r/min离心5min，弃上清;用无血清DMEM培养液悬浮组织，800r/min离心5min，弃上清;加适量含100mL/L新生牛血清的DMEM培养液，连同组织块转至6孔板，37℃，950mL/L空气、50mL/L CO2、100%湿度条件下培养。每2～3d换液1次。取第5～8代细胞用于实验。免疫组化法检测波形丝蛋白和角蛋白抗体以鉴定细胞来源。

　　1.9 实验分组 将转染与未转染靶向性TGFβ ⅡR基因沉默的T细胞与人牙周膜细胞置于含有1.0g/L的LPS(美国Sigma公司，按说明书配制)和1.0mg/L黄芩苷溶液(中国药品生物制品检定所，精密称取干燥至恒重的黄芩苷标准品5.0mg，用甲醇溶解并定容至100mL容量瓶中，再将其浓度稀释至1.0mg/L)的培养基中，共培养48h。实验分为6组：①正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+转染siRNA1的T细胞+黄芩苷;②正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+转染siRNA1的T细胞;③正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+正常T细胞+黄芩苷;④正常牙周膜成纤维细胞+内毒素+正常T细胞;⑤正常牙周膜成纤维细胞+黄芩苷;⑥正常牙周膜成纤维细胞.

　　1.10 RTPCR检测 用TRIZOL试剂盒提取牙周膜细胞总RNA，取2.5μg总RNA用逆转录试剂盒进行转录。OPG分子引物序列：上游引物5′TCAAGCAGGAGTGCAATCG3′，下游引物5′AGAATGCCTCCTCACACAGG3′，该引物将产生342bp的cDNA片段。RANKL分子引物序列：上游引物5′GGCTCATGGTTAGATCTGGC3′，下游引物5′TGACCAATACTTGGTGCTTCC3′，该引物将产生351bp的cDNA片段。βactin分子引物序列：上游引物5′CAATTCATGTTTGAGACCTTCAA3′，下游引物5′CCGGATCCATCTCTTCCTGGAAGTCCA3′，该引物将产生362bp的cDNA片段。上述引物序列由由上海Sangon公司合成。取PCR反应产物15μL在15g/L琼脂糖凝胶上电泳，置于凝胶电泳成像仪，利用凝胶系统分析软件Bandscan 5.0进行半定量分析。

　　1.11 统计学处理 所有数据均以均数±标准差表示，采用SPSS10.0统计学软件进行方差分析，显著性水准a=0.05。

　　2 结 果

　　2.1 重组质粒的鉴定 质粒转化后，从平皿上挑取3个单克隆菌落提取质粒，酶切鉴定后10g/L琼脂糖凝胶电泳分析，重组质粒和对照质粒泳动速度相同，初步表明质粒重组成功。将鉴定正确的质粒进行DNA序列鉴定，结果与设计的目标序列完全一致，表明已成功构建了TGFβⅡR siRNA表达载体。

　　2.2 潮霉素筛选浓度的确定和转染细胞的筛选 经不同浓度的潮霉素筛选后，T细胞在含 100mL/L FBS、200mg/L G418和200mg/L潮霉素的DMEM培养基中培养到第8天时全部死亡;其他条件保持不变，仅潮霉素为150mg/L时培养到第10天时细胞仍有部分存活。因此，选择200mg/L潮霉素为转染后T细胞的筛选浓度。

　　2.3 siRNA转染对T细胞生长的影响 分别转染siRNA1和siRNA2的T细胞生长速度与对照组正常T细胞的生长速度相似(图1)，各组间差别无统计学意义(P>0.05)。

　　图1 T细胞的生长曲线

　　Fig.1 Growth curve of T cells

　　2.4 siRNA转染的T细胞中TGFβⅡR的表达 RTPCR(图2A)和Western blot(图2B)结果均显示，转染siRNA1的T细胞组的TGFβⅡR 产物的条带明显暗于对照条带，转染siRNA2的T细胞组的TGFβⅡR表达产物与对照组细胞相比无明显变化。提示转染siRNA1的T细胞组的TGFβⅡR mRNA的表达被明显抑制。表明siRNA1对T细胞中TGFβⅡR mRNA的降解作用是高效的、特异的。

　　2.5 各组OPG和RANKL在牙周膜细胞上的表达 经RTPCR检测，各组OPG和RANKL在牙周膜细胞上的表达各不相同(图3)。

　　2.6 各组RANKL/OPG比值的比较 以组别为x轴，以RANKL与OPG的比值为y轴，建立图4。结果显示，RANKL/OPG比值在各实验组中由大到小依次为：实验组④>②>①>③>⑥>⑤，组间比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

　　3 讨 论

　　本实验采用Ambion公司开发的哺乳动物细胞表达载体pSilencer RNA系统，将编码针对TGFβⅡR siRNA的DNA模板定向克隆，使插入序列能被有效转录，从而形成内源性表达的RNA。RNA正向链的3端Psilencer载体稳定表达的siRNA可持续、高效、特异性地抑制目的基因的表达。

　　TGFβ受体目前共发现8种，研究比较清楚的是受体I、受体Ⅱ和受体Ⅲ。这3种受体具有较高的同源性，其中受体I和受体Ⅱ参与TGFβ的信号传导，而受体Ⅲ与信号传导无关[9]。TGFβ与细胞膜表面的Ⅱ型受体形成复合物，经活化才能产生信号转导作用。在此过程中Ⅱ型受体胞质区的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域可将Ⅰ型受体胞浆区GS结构域的丝氨酸/苏氨酸磷酸化，继而Ⅰ型受体磷酸化。活化后的Ⅰ型受体进一步作用于细胞内的下游分子，使TGFβ的信号细胞内转导。Ⅱ型TGFβ受体的基因中含有一段10bp的多聚A重复序列，该序列增加或丢失碱基都将导致Ⅱ型TGFβ受体变构而失活,从而使TGFβ不能与受体正确的结合并发挥生物学作用。由此可见，TGFβⅡR在TGFβ的信号传导过程中起着不可替代的关键作用。因此，本实验选择TGFβⅡR作为基因沉默的靶点，能够准确地阻断TGFβ的信号传导。

　　本实验首先构建两个靶向TGFβⅡR的siRNA真核表达载体，并将其中之一的siRNA1成功转染了正常人外周血T细胞，使T细胞表面的TGFβⅡR基因沉默，TGFβ的信号传导过程被阻断，从而使T细胞活性增高。siRNA2载体未能成功转染T细胞的原因，考虑与转染条件(脂质体的用量、DNA密度、细胞密度、脂质体和DNA混合孵育时间)未达到最佳优化有关。

　　LIU等[10]实验显示，RANKL mRNA在重度牙周炎中的表达显著高于中度牙周炎和正常人群,而OPG mRNA在重度及中度牙周炎中表达则低于正常人群，RANKL mRNA/OPG mRNA比值为重度牙周炎>中度牙周炎>正常人群，从而认为，RANKL/OPG比值的升高可能是牙周炎进展的一个危险因素。TENG等[1112]亦证明,活化的T细胞表达高水平的RANKL,牙槽骨明显吸收;抑制T细胞的RANKL的表达,牙槽骨的吸收明显减少，且RANKL/OPG之比降低90%，表明RANKL/OPG比值的升高可能是牙槽骨吸收的关键因素。故本实验采用RANKL/OPG的比值来评估黄芩苷对PDLC OPGRANKL的影响。

　　WANG等[4]研究证实，黄芩苷0.01mg/L、淫羊霍苷0.01mg/L、大黄素10mg/L组合时抑制LPS刺激下人牙龈成纤维细胞中PGE2产生的作用最强，亦可抑制实验性牙周炎牙槽骨吸收。本实验希望观察黄芩苷单独作用于PDLC时的表现，故将黄芩苷的浓度适当增大10倍和100倍,即0.01mg/L、0.1mg/L和1.0mg/L作为检测浓度。在前期的动物实验中，我们证实1.0mg/L的黄芩苷抑制实验性牙槽骨吸收的作用最强，于是在本实验中选择1.0mg/L黄芩苷作为检测浓度。

　　LPS是革兰氏阴性菌所独有的一种致病物质,对牙周组织具有很高的毒性,被称为是牙周炎症的主要病因之一。通过牙龈局部注射LPS来建立牙周炎动物模型的方法已由SUNY Stony Brook动物委员会认可[1314]。文献报道，1.0g/L的LPS用于建立牙周炎动物模型有良好的效果。在我们前期的动物实验中也证实了这一结论。故在本次实验中选择1.0g/L的LPS作为一个重要的影响因素。

　　PDLC是牙周组织中最重要的一种细胞。PDLC位于牙槽骨和牙骨质之间,其分泌的OPG在抵御炎症组织中RANKL介导的骨吸收中发挥一定的防御功能。在本研究中，实验组⑥中RANKL和OPG的表达证实PDLC能够产生RANKL、OPG，且OPG的量大于RANKL，与以往的文献报道相符[1 ]。RANKL/OPG比值在实验组⑤低于实验组⑥(P<0.05)，表明黄芩苷可以直接作用于PDLC，使PDLC表面的RANKL/OPG比值略有降低。RANKL/OPG比值在实验组④显著高于实验组⑥，这一结论也证实了以往的研究。比较实验组③和实验组④中RANKL/OPG比值，发现在实验组④中加入黄芩苷后，PDLC表面的RANKL/OPG明显下降。说明在TGFβ信号传导正常时，黄芩苷可以显著降低PDLC表面的RANKL/OPG比值，从而使牙槽骨吸收、牙周炎进展的危险因素降低。

　　那么，当TGFβ信号传导被阻断时，黄芩苷是否还会降低PDLC表面的RANKL/OPG比值呢?分析实验组①和实验组③中RANKL/OPG比值，发现实验组①高于实验组③，即当T细胞表面的TGFβⅡR被沉默，TGFβ的信号传导被阻断的情况下，黄芩苷降低PDLC表面的RANKL/OPG比值的作用明显减弱，说明TGFβ的信号传导在黄芩苷影响PDLC表面的RANKL/OPG比值的过程中起到重要作用。分析认为黄芩苷可能通过增强TGFβ对T细胞的抑制作用，引起T细胞活性降低、数量减少，导致T细胞在内毒素作用下分泌的TNFα等炎症因子减少，降低RANKL/OPG比值，进而降低破骨细胞形成，减少骨丢失。

　　既然TGFβ信号传导的阻断使黄芩苷发挥降低RANKL/OPG比值的作用明显减弱，那么黄芩苷的这种作用是否被完全阻断了呢?将黄芩苷从实验组①中去掉，比较实验组①和实验组②中RANKL/OPG比值，结果发现实验组①中RANKL/OPG比值较低，也就是说，即便T细胞表面的TGFβⅡR基因沉默，TGFβ信号传导被阻断后，黄芩苷依然可以降低PDLC表面RANKL/OPG比值。这说明黄芩苷并非只通过TGFβ来影响PDLC表面的RANKL/OPG比值，而是亦通过其他通路对PDLC表面的RANKL/OPG进行调控。

　　综上所述，本研究证实黄芩苷可以降低PDLC表面RANKL/OPG比值;TGFβ信号传导在黄芩苷影响PDLC表面RANKL/OPG比值的过程中起着重要作用;黄芩苷并非只通过TGFβ途径，而亦可能通过其他通路对PDLC表面的RANKL/OPG进行调控。至于黄芩苷是如何增强TGFβ对T细胞的抑制作用的，对分泌TGFβ的巨噬细胞等作用怎样，及黄芩苷还通过什么样的通路来影响PDLC表面RANKL/OPG比值，这些问题都有待于进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1]KANZAKI H, CHIBA M, SHIMIZU Y, et al. Dual regulation of osteoclast differentiation by periodontal ligament cells through RANKL stimulation and OPG inhibition [J]. J Dent Res, 2001, 80(3):887891.

　　[2]HASEGAWA T, YOSHIMURA Y, KIKUIRI T, et al. Expression of receptor activator of NFkappa B ligand and osteoprotegerin in culture of human periodontal ligament cells [J]. J Periodontal Res, 2002, 37(6):405411.

　　[3]ZHANG D, YANG YQ, LI XT, et al. The expression of osteoprotegerin and the receptor activator of nuclear factor kappa B ligand in human periodontal ligament cells cultured with and without 1alpha, 25dihydroxyvitamin D3 [J]. Arch Oral Bio, 2004, 49(1):7176.

　　[4]WANG GF, WU ZF, WAN L, et al. A study of the inhibitory effects of compound of icariin, emodin and baicalin on bone absorption in experimental periodontitis in rats [J]. J Clin Stomatol, 2005, 21(6):321323.

　　[5]ROGGIA C, GAO Y, CENCI S, et al. Upregulation of TNFproducing T cells in the bone marrow: a key mechanism by which estrogen deficiency induces bone loss in vivo [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98(24):1396013965.

　　[6]BAKER PJ, HOWE L, GARNEAU J, et al. T cell knockout mice have diminished alveolar bone loss after oral infection with Porphyromonas gingivalis [J]. FEMS Immunol Med Microbiol, 2002, 34(1):4550.

　　[7]YU Y, YANG YJ, TAO YG. Effect of baicalin and dexamethasone on cytokines in brain tissue of infectious brain edema [J]. Hunan Yi Ke Da Xue Xue Bao, 2000, 25(6):519521.

　　[8]CHUNG CP, PARK JB, BAE KH. Pharmacological effects of methanolic extract from the root of Scutellaria baicalensis and its flavonoids on human gingival fibroblast [J]. Planta Med, 1995, 61(2):150153.

　　[9]YAMADA SD, BALDWIN RL, KARLAN BY. Ovarian carcinoma cell cultures are resistant to TGFbeta1mediated growth inhibition despite expression of functional receptors [J]. Gynecol Oncol, 1999, 75(1):7277.

　　[10]LIU D, XU JK, FIGLIOMENI L, et al. Expression of RANKL and OPG mRNA in periodontal disease: possible involvement in bone destruction [J]. Int J Mol Med, 2003, 11(1):1721.

　　[11]TENG YT, NGUYEN H, GAO X, et al . Functional human Tcell immunity and osteoprotegerin ligand control alveolar bone destruction in periodontal infection [J]. J Clin Invest, 2000, 106(6):749752.

　　[12]VALVERDE P, KAWAI T, TAUBMAN MA. Selective blockade of voltagegated potassium channels reduces inflammatory bone resorption in experimental periodontal disease [J]. J Bone Miner Res, 2004, 19(1):155164.

　　[13]DUMITRESCU AL, ABDELALEEM S, MORALESAZA B, et al. A model of periodontitis in the rat: effect of lipopolysaccharide on bone resorption, osteoclast activity, and local peptidergic innervation [J]. J Clin Periodontol, 2004, 31(8):596603.

　　[14]RAMAMURTHY NS, RIFKIN BR, GREENWALD RA, et al. Inhibition of matrix metalloproteinasemediated periodontal bone loss in rats: a comparison of 6 chemically modified tetracline [J]. J Periodontal, 2002, 73(7):726734