IL1B+3954/Taq Ⅰ基因多态性与慢性牙周炎易感性的关系

　　作者：韩冰1,苟建重1,陈曦2,李生斌3　　作者单位：西安交通大学医学院：1. 口腔医院，陕西西安 710004;2. 第一附属医院口腔科，陕西西安 710061;3. 环境与疾病相关基因教育部重点实验室，陕西西安 710061

　　【摘要】 目的 探讨IL1B +3954/Taq Ⅰ基因多态性与慢性牙周炎易感性的关系。方法 收集汉族人群116名受试者，其中包括66例中重度慢性牙周炎(CP)患者和50例牙周健康对照者，提取外周静脉血白细胞DNA，采用标准化的聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCRRFLP)的方法，进行IL1B+3954/Taq Ⅰ基因型的检测，比较各基因型检出率的差别。结果 IL1B+3954/Taq Ⅰ位点均以A1/A1基因型占优势， CP组A1/A2基因型检出率和健康对照组相比无统计学差异。结论 IL1B+3954/Taq Ⅰ等位基因2可能与汉族人群中重度慢性牙周炎遗传易感性无关。

　　【关键词】 牙周炎;白细胞介素1;单核苷酸多态性;基因型;遗传易感性

　　Association between IL1B+3954/Taq Ⅰ gene polymorphisms

　　and chronic periodontitisHAN Bing1, GOU Jianzhong1, CHEN Xi2, LI Shengbin3

　　(1. Stomatological Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 71004;

　　2. Department of Stomatology, the First Affiliated Hospital, Medical School of

　　Xian Jiaotong University, Xian 710061; 3. Key Laboratory of Environment of Genes

　　Related to Disease, Ministry of Education Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)ABSTRACT: Objective To study whether specific IL1B+3954/Taq Ⅰ genotype alleles are associated with chronic periodontitis (CP) in Chinese of the Han nationality. Methods CP group consisted of 66 patients while healthy controls group consisted of 50 subjects. Anticoagulated peripheral blood sample was obtained from each subject and genomic DNA was extracted from each sample. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) at IL1B+3954/Taq Ⅰ were analyzed by standard polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphisms (PCRRFLP) assay. Results In the control group, higher numerical values of the A1/A1 genotype were observed for the IL1B+3954/Taq Ⅰ SNPs (84.0%), and the A2+ genotype was present in 16% of this sample. Statistical analysis revealed no significant difference between the two groups. Conlusion There is no evidence in our study supporting the association between single nucleotide polymorphisms (SNPs) of the IL1B+3954/Taq Ⅰ gene and prevalence and/or severity of chronic periodontitis.

　　KEY WORDS: periodontitis; interleukin1; single nucleotide polymorphism; genotype; susceptibility

　　牙周炎是一种复杂的多基因遗传疾病，发病机制十分复杂，是自身免疫反应、环境因素和微生物因素间相互作用的结果。白细胞介素1(IL1)家族是一类炎前细胞因子，在牙槽骨吸收、牙周结缔组织破坏中起着重要的作用，是调节炎症反应的关键因子[1]。由于其可能影响牙槽骨和牙周成纤维细胞的代谢，因此作为牙周病潜在的病原因子已受到广泛重视。

　　目前国内外已经对IL1基因簇基因多态性与牙周炎，特别是与慢性牙周炎(chronic periodontitis, CP)的易感性、严重程度、治疗效果及疗效维护方面进行了广泛而深入的研究，但所获得的结果尚有较大争议[24]。本研究通过病例对照研究，观察了IL1B+3954/Taq Ⅰ位点基因多态性与慢性中重度牙周炎易感性的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂和仪器 PCR扩增仪(PERKIN ELMER Gene Amp PCR System 9600, USA);高速台式离心机(HERMLE Z230MR, Germany);垂直电泳仪(DYYⅢ 28A，北京);Taq Ⅰ限制性内切酶(宝生物工程大连有限公司)。

　　1.2 病例收集 选择在西安交通大学医学院口腔医院口腔内科门诊就诊的中重度慢性CP患者。入选者3代均为汉族，无口腔正畸治疗史，无明显错颌畸形，无全身系统性疾病(糖尿病、心血管疾病和血液性疾病)，半年内未接受过牙周治疗，3个月内未服用抗菌素，妇女未妊娠。CP组纳入标准：口腔内至少有4个探诊深度大于5mm的位点，X线片显示牙槽骨吸收超过根长1/2。选取CP患者66例，年龄23～68岁，平均(47.73±9.93)岁;正常对照组50例，年龄21～67岁，平均(42.02±12.33)岁，均无病理性牙周附着丧失。CP组和健康对照组间的年龄分布均衡，经统计学分析差异无统计学意义。

　　1.3 样本采集和DNA提取 取研究对象前臂静脉血2mL，0.5mol/L EDTA抗凝，Chelex100溶液提取外周静脉血白细胞DNA，4℃冷室保存备用。

　　1.4 IL1B+3954/Taq Ⅰ多态性目的基因片段的扩增和酶切 引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成：A：5′CTCAGGTGTCCTCGAAGAAATCAA3′;B：5′GCTTTTTTGCTGTGAGTCCCG3′。PCR反应条件：总反应体系40μL，引物A、B各2.4μL(10μmol/L)，dNTP 14μL(1mmol/L)，MgCl2 2.4μL(25mmol/L)，10×PCR缓冲液4μL，Taq DNA聚合酶1.0μL(2.5u/μL)，模板DNA 8μL，无菌去离子水5.8μL补足体积至40μL。

　　循环参数：94℃ 5min预变性后，进入主循环，包括5×(94℃、54℃、72℃各1min)，25×(94℃、52℃、72℃各1min);最后72℃延伸5min。25g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，证实获得194bp目的基因片段。

　　PCR产物酶切：PCR产物酶切体系20μL，PCR产物10μL，Taq Ⅰ限制性内切酶0.6μL(10u/μL)，10×NEB Buffer 2μL，去离子水7.4μL补足体积至20μL，混匀后置于65℃水浴摇床过夜进行酶切，酶切产物保存于-20℃冰箱。PCR产物经60g/L PAGE垂直电泳，硝酸银染色证实获得目的基因片段。

　　1.5 统计学处理 所有统计分析均用SPSS11.5统计软件完成。采用Fisher确切概率法(双侧检验)，检验水准α=0.05;关联强度采用比值比(odds ratios, OR)和95%可信区间(confidence intervals, CI)表示。

　　2 结 果

　　2.1 基因型测定的电泳结果 IL1B+3954/Taq Ⅰ基因PCR扩增产物片段长度为194bp，经Taq Ⅰ限制性内切酶酶切后获得97bp、85bp两个片段为等位基因1;获得182bp片段为等位基因2。6.03%受检者(7/116)携带等位基因2，且均为A1/A2杂合子。

　　2.2 CP组及对照组中各基因型分布情况的比较 IL1B+3954/Taq Ⅰ均以A1/A1基因型占优势，CP组A1/A2基因型检出率与健康对照组之间无显著性差异(OR=1.01，95% CI=0.22～4.74，P=1.000)。 IL1B+3954/Taq Ⅰ基因型和等位基因在CP组和健康对照组中的分布

　　3 讨 论

　　IL1是多功能细胞因子，包括IL1α和IL1β，IL1ra是IL1受体的天然拮抗剂。编码IL1α、ILβ和IL1ra的IL1A、IL1B和IL1RN基因合称IL1基因簇，定位于染色体2q13，全长430bp[5]，存在多个多态性位点。该家族基因上的几个多态性已被证实有可能成为某些自身免疫性疾病和炎症性疾病的易感或危险因素[67]。IL1β能诱导牙周前体细胞分化为破骨细胞，促进牙周成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶，激活单核巨嗜细胞使其分泌其他炎症介质如前列腺素E2(PGE2)、肿瘤坏死因子α(TNFα)等，从而介导牙槽骨吸收和胶原降解，在牙周炎的发生、发展中起着重要作用[8]。

　　有研究证明，IL1B+3954等位基因2与IL1β的高表达有关，且呈基因剂量效应;A1/A2基因型患者的单核巨噬细胞受内素素(LPS)刺激时分泌的IL1β量是A1/A1基因型患者的2倍[9]。对中国汉族人群的研究表明，IL1B+3954等位基因2在CP患者和快速进展性牙周炎患者中的检出率显著高于正常对照组[10];也有研究结果认为IL1A889和IL1B+3953等位基因2的阳性复合基因型与新疆维吾尔族重度CP的易感性无关，显示了牙周炎遗传背景在不同民族间的差异[3]。

　　由于受采样时间及实验经费等的限制，本实验仅进行了小样本研究，且仅收集中重度CP患者和牙周健康对照者的静脉血，提取外周静脉血白细胞DNA，采用标准化的聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCRRFLP)的方法，进行IL1B+3954/Taq Ⅰ基因型的检测，比较各基因型检出率的差别。结果显示，在中国汉族人群中IL1B+3954/Taq Ⅰ位点均以A1/A1基因型占优势，IL1B+3954位点等位基因2的携带率很低，其复合等位基因阳性出现频率过低，结果分析未能发现IL1B+3954等位基因2在CP组和健康对照组之间分布有统计学差异。提示IL1B +3954/Taq Ⅰ等位基因2可能与汉族人群中重度慢性牙周炎遗传易感性无关。因此认为IL1B+3954等位基因2还不能作为中国汉族人群中重度CP易感性的标志。

　　CP是慢性炎症性口腔感染性疾病。由于炎症反应中各种细胞因子调节网络的复杂性，要揭示各基因位点和炎症表现型之间的相关关系，除需对单个基因的相关性进行深入研究之外，还需要进行多个基因位点的综合研究，扩大样本量，这样才可能揭示遗传因素在牙周炎发生发展中的作用。

　　【参考文献】

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　　[3]钟良军，张蕴惠，章锦才，等. 白细胞介素1基因多态性与维吾尔族居民慢性牙周炎易感性的关系 [J]. 中华医学遗传学杂志, 2002, 19(5):405408.

　　[4]FERREIRA SB JR, TROMBONE AP, REPEKE CE, et al. An interleukin1beta (IL1beta) singlenucleotide polymorphism at position 3954 and red complex periodontopathogens independently and additively modulate the levels of IL1beta in diseased periodontal tissues [J]. Infect Immun, 2008, 76(8):37253734.

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　　[6]MANSFIELD JC, HOLDEN H, TARLOW JK, et al. Novel genetic association between ulcerative colitis and the antiinflammatory cytokine interleukin1 receptor antagonist [J]. Gastroenterology, 1994, 106(3):637642.

　　[7]MCDOWELL TL, SYMONS JA, PLOSKI R, et al. A genetic association between juvenile rheumatoid arthritis and a novel interleukin1 alpha polymorphism [J]. Arthritis Rheum, 1995, 38(2):221228.

　　[8]ENGEBRETSON SP, GRBIC JT, SINGER R, et al. GCF IL1beta profiles in periodontal disease [J]. J Clin Periodontol, 2002, 29(1):4853.

　　[9]POCIOT F, MOLVIG J, WOGENSEN L, et al. A TaqⅠ polymorphism in the human interleukin1β (IL1β) gene correlates with IL1β secretion in vitro [J]. Eur J Clin Invest, 1992, 22(6):396402.

　　[10]段海燕，章锦才，张蕴惠. IL1基因多态性与牙周炎关系的研究 [J]. 华西口腔医学杂志, 2002, 20(1):4851