FOXP3和GITR 在口腔扁平苔藓中的表达及意义
发表时间：2011-12-08 浏览次数：635次
作者：臧磊,漆明,刘,丽,韩恩善,李国 作者单位：1.宁夏医科大学，银川 750004; 2.宁夏医科大学附属医院口腔科，银川 7500043.宁夏医科大学附属医院病理科，银川
【摘要】 目的 研究FOXP3、GITR在口腔扁平苔藓(OLP)组织中的表达及其意义。方法 采用免疫组化方法检测30例OLP组织和15例口腔正常黏膜(NOM)组织中FOXP3、GITR的表达。结果 NOM组FOXP3和GITR均阴性表达;OLP组FOXP3和GITR表达分别较NOM增加(P<0.01);FOXP3和GITR在OLP组中的表达存在正相关关系。结论 OLP患者FOXP3和GITR呈现高表达，二者可能参与了OLP的发病。
【关键词】 口腔扁平苔藓;FOXP3;GITR
口腔扁平苔藓(oral lichen planus，OLP)是一种常见的口腔黏膜疾病，其发病可能与精神因素、胃炎及自身免疫有关[1]。调节性T细胞(regulatory T-cells，Treg)在维持机体免疫耐受状态，防止自身免疫疾病发生、抗移植物排斥以及肿瘤免疫中发挥重要作用[2]。叉头状转录因子3(forkhead transcription facter3，FOXP3)是特异性表达于调节性T细胞内的标志性分子。糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，GITR)是调节性T细胞上的一个表面分子，具有许多重要的生物学活性，如参与细胞的增殖、分化和存活等。本研究采用免疫组化方法检测了FOXP3和GITR在口腔正常黏膜(normal oral mucosa，NOM)和OLP组织中的表达，探讨FOXP3和GITR在OLP发病中的作用。
1 材料与方法
1.1 研究对象
1.1.1 健康对照组 15例NOM组织来自于自愿捐献者的颊黏膜，其中男6例，女9例，年龄21～57岁，均无系统性疾病，肝肾功能正常。
1.1.2 OLP患者组 30例OLP组织标本来自于宁夏医科大学附属医院口腔科门诊初次就诊者的未糜烂颊黏膜，均经病理诊断，其中男11例，女19例，年龄27～63岁，均未使用过激素类药物或免疫调节剂。
1.2 主要试剂 兔抗人FOXP3多克隆抗体、兔抗人GITR多克隆抗体(浓缩型，北京博奥森公司)，PV9001免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒(北京中杉公司)。
1.3 方法 采用免疫组织化学染色PV9001法检测FOXP3和GITR的表达强度，具体操作步骤如下：切取4μm厚切片60℃烤片过夜;脱蜡水化;抗原修复：枸橼酸缓冲液高温高压修复，自然凉至室温，PBS洗5min，3次;3%H2O2去离子水孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶，PBS洗5min，3次;一抗孵育，4℃过夜;复温20min，PBS洗5min，3次;滴加试剂1(聚合物辅助剂)，室温20min，PBS洗5min，3次;滴加试剂2(辣根酶标记抗兔IgG多聚体)，室温20min，PBS洗5min，3次;DAB显色，镜下观察结果，适时终止;复染，封片。实验均设不加一抗的阴性对照。所有实验标本均经石蜡包埋，切片，HE染色检查。
1.4 结果判定 FOXP3和GITR染色的阳性信号为胞浆出现棕黄色颗粒。结合染色强度和阳性细胞数分级。选取表达最强的部位，按着色程度分级：基本未着色，染色与背景相似者为0分;着色浅、略高于背景者为1分;中度着色，明显高于背景者为2分;强染，着色深棕色为3分。视野下阳性细胞数<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。二项计分相加后分为4级：0～1分为(-)，2分为(+)，3分为(++)，4分以上为(+++)，+及以上判定为阳性。
1.5 统计学方法 应用统计分析软件SPSS 11.5进行统计分析，等级资料采用Wilcoxon秩和检验，相关分析采用Spearman相关分析法。
2 结果
2.1 FOXP3、GITR在口腔正常黏膜和口腔扁平苔藓组织中的表达情况
FOXP3免疫组化染色结果，GITR免疫组化染色结果。结果显示FOXP3和GITR在NOM无表达，在OLP中FOXP3和GITR高表达。FOXP3在NOM和OLP组织中表达情况经Wilcoxon秩和检验，Z=-4.464，P<0.01，差异有统计学意义;GITR在NOM和OLP组织中表达情况经Wilcoxon秩和检验，Z=-5.509，P<0.01，差异有统计学意义。
2.2 GITR和FOXP3表达程度的相关性
FOXP3的表达与GITR表达呈明显正相关，r=0.537，P<0.01，即二者在OLP中的表达水平有同时增强或减弱的趋势。 FOXP3、GITR在口腔正常黏膜和扁平苔藓组织中的表达(例数)
3 讨论
OLP是一种常见的口腔黏膜疾病，病变可呈条纹状、斑块状白色损害以及糜烂、萎缩等多种表现，以基底细胞液化变性和固有层炎性细胞浸润为主要病理特征。尽管OLP的病因不明确，但许多证据表明OLP是一种由T细胞介导的自身免疫性疾病[3]，辅助性T细胞和调节性T细胞是否平衡是OLP发病的一个决定因素。调节性T细胞是一种具有免疫调节功能的特定细胞亚群，能够抑制自我反应性T细胞的活化及功能，在维持外周免疫耐受中起至关重要的作用，其天然表型为CD4+CD25+FOXP3+。
2001年Brunkow等[4]首次报道FOXP3是CD4+ CD25+调节性T细胞发育的一个关键转录因子，在调节性T细胞的发育及发挥免疫抑制效应中起着决定性作用[5-7]。FOXP3在调节性T细胞发育中起重要作用的证据是在Scurfy小鼠和FOXP3剔除小鼠体内，通过逆转录病毒转染小鼠初始T细胞使其表达FOXP3，继而可以表达与自然产生的调节性T细胞相似的细胞表型，进而能阻止淋巴细胞增殖病[8]。现有研究证明CD4+CD25+FOXP3+T细胞是一种具有免疫调节作用的细胞，在自身免疫性疾病和移植物抗宿主病中起重要的作用[9];免疫失调性基因疾病、多发性内分泌腺体病、小肠免疫性疾病、X-相关综合征(IPEX)均由FOXP3基因突变所致[10];多种自身免疫病，如幼年特发性关节炎、自身免疫性胃炎、I型糖尿病、多发性硬化症等均由FOXP3的表达降低或功能缺陷引起[11];说明FOXP3对正常免疫功能的维持和调控起着重要的作用。最近有研究表明，FOXP3的表达与疾病病变的活动度成负相关，这些病变包括系统性红斑狼疮、结核分枝杆菌、实验性重症肌无力和格林巴利综合征等炎症和自身免疫性疾病[12]。本研究结果显示FOXP3在NOM无表达，在OLP中FOXP3高表达，与X-a Tao等[13]免疫组化染色结果相符，在OLP中FOXP3表达率为76.6%，高于NOM组(P<0.01)，可能是由于OLP处于不同程度的活动期和不同的临床分型，导致了FOXP3的表达增高。有文献报道FOXP3在多种肿瘤细胞中高表达，而OLP又被定为可能的癌前状态，这也可能是FOXP3在OLP中过高表达的原因。
GITR是肿瘤坏死因子受体超家族中的第18个成员，2002年发现GITR持续高水平表达于天然调节性T细胞表面，并能消除调节性T细胞的免疫抑制作用。随后的研究显示，除了调节性T细胞外，激活的CD4+CD25-T细胞、CD8+CD25+T细胞、NK细胞均表达GITR[14-15]。最近有研究报道，激活效应T细胞上的GITR后能使这些细胞抵抗CD4+CD25+调节性T细胞的作用[16]。因此可以推测，GITR 既可反映体内调节性T细胞的数量及功能状况，也与效应T淋巴细胞的功能状况密切相关。本研究结果显示GITR在NOM无表达，在OLP中表达率高达96.6%，高于NOM组(P<0.01)，说明GITR的高度表达使调节性T细胞的功能受到抑制，GITR可能与OLP的发病及病变进展有关。
FOXP3特异性的表达于调节性T细胞，GITR与调节性T细胞的功能密切相关，而FOXP3和GITR在OLP中的表达呈正相关，可能是由于FOXP3的表达增高诱发了GITR的表达，反映了机体免疫反应增强，调节性T细胞的功能降低。故认为OLP发病时GITR与FOXP3呈现高表达，二者可能参与了OLP的发病。
【参考文献】
[1] 漆明，王兵，张敬，等.口腔扁平苔藓病的相关危险因素分析[J].宁夏医学院学报，2005，27(6)：436.
[2] Sakaguchi S，Sakaguchi N，Shimizu J，et al.Immunologic tolerance maintained by CD4+CD25+ regulatory T-cells：their common role in controlling auto-immunity，tumor immunity，and transplantation tolerance[J].Immunol Rev，2001，182：18-32.
[3] Thornhill MH.Immune mechanisms in oral lichen planus[J].Acta Odontol Scand，2001，59(3)：174-177.
[4] Brunkow ME，Jeffery EW，Hjerrild KA，et al.Disruption of a new forkhead /winged-helix protein，scurfin，results in the fatal lymphop roliferative disorder of the scurfy mouse[J].Nat Genet，2001，27(1)：68-73.
[5] Hori S，Nomura T，Sakaguchi S.Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3[J].Science，2003，299(5609)：1057-1061.
[6] Fontenot JD，Gavin MA，Rudensky AY，et al.Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells[J].Nat Immunol，2003(4)：330-336.
[7] Khattri R，Cox T，Yasayko SA，et al.An essential role for scurfy in CD+4 CD25+regulatory T cells[J].Nat Immunol，2003，4(4)：337-342.
[8] Ziegler SF.FOXP3：of mice and men[J].Annu Rev Immunol，2006，24：209-226.
[9] Bayer AL，Jones M，Chirinos J，et al.Host CD4+CD25+T cells can expand and comprise a major component of the Treg compartment after experimental HCT[J].Blood,2009，1 13：733-743.
[10] Torgerson TR，Ochs HD.Immune dysregulation，polyen-docrinopathy，enteropathy，X-linked：forkhead box protein3 mutations and lack of regulatory T cells[J].J Allergy ClinImmunol，2007，120(4)：744-750.
[11] Sakaguchi S，Ono M，Setoguchi R，et al.Foxp3+CD25+CD4+natural regulatory T cells in dominant self-tolerance and autoimmune disease[J].Immunol Rev，2006，212：8-27.
[12] Beyersdorf N，Gaupp S，Balbach K et al.Selective targeting of regulatory T cells with CD28 superagonists allows effective therapy of experimental autoimmune encephalomyelitis[J].J Exp Med,2005,202：445-455.
[13] X-a Tao，J Xia，X-b Chen et al.FOXP3+ T regulatory cells in lesions of oral lichen planus correlated with disease activity[J].Oral Diseases，2009，1(16)：76-82.
[14] Lorenzo C，Francesco L，Elena L，et al.Human CD8+CD25+thymocytes share phenotypic and functional featureswith CD4+CD25+regulatory thymocytes[J].Blood，2003，102：4107-4114.
[15] Hanabuchi S，Watanabe N，Wang YH，et al.Human plas-macytoid predendritic cells activate NK cells through glu-cocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor-ligand(GITRL)[J].Blood，2006，107(9)：3617-3623.
[16] Stephens GL，Mchugh RS，Whitters MJ，et al.Engagement of Glucocorticoid2induced TNFR family2related recep tor on effector T cells by its ligand mediates resistance to supp ression by CD4+CD25+ T cells[J].J Immunol，2004，173：5008-5020.
