牙周病患牙根面的不同处理对牙周膜成纤维细胞生长的影响

　　作者：戴海燕,邓芳成,蒋旭　　作者单位：1. 海南医学院口腔系,海南 海口 570102;2.贵阳中医学院附二院口腔科,贵州 贵阳 551000

　　【摘要】目的：研究牙周病患牙累及的牙根面经EDTA脱矿和富血小板血浆(PRP)单独及联合处理后对人牙周膜成纤维细胞附着、增殖的影响。方法 ：以因牙周病不能保留而拔除的患牙制备的牙根片为对照组，PRP和EDTA脱矿单独及联合处理患牙根片为实验组，用细胞计数法及四甲基偶氮唑盐(MTT)比色实验分析人牙周膜成纤维细胞在病变根面上的附着和增殖。结果：未处理组的根片上有少量的细胞附着;根片经PRP或EDTA脱矿单独处理能明显增加细胞的附着(P<0.05);二者联合处理促附着效果明显增强(P<0.01)。未处理组根片上生长的细胞随时间延长数量反而下降;经PRP或EDTA单独处理的根片上的细胞有少量的增殖(P>0.05);二者联合处理细胞增殖明显(P<0.05)。结论：EDTA根面脱矿和PRP能有效促进人牙周膜成纤维细胞在牙周病患牙根面上的附着和增殖。

　　【关键词】 富血小板血浆;牙周膜成纤维细胞;附着;增殖

　　Effects of deminerazation and plateletrich plasma on periodontal ligament fibroblasts attachment and proliferation on diseased root surfaces

　　DAI Haiyan

　　(Department of Operative Dentistry, Hospital of Stomatology, Hainan Medical College Hai Kou 570102，China)

　　[ABSTRACT] Objective: To evaluate the effect of EDTA and plateletrich plasma (PRP) on the attachment and proliferation of human periodontal ligament fibroblasts on diseased root surfaces in vitro. Methods： Periodontitisaffected teeth were collected and sectioned with a watercooled diamond disc to prepare the 4mm×4mm diseased root slices. The diseased root surfaces slices were then scaled .Test slices were exposured to either EDTA (24%,pH=6.7) or PRP. The controls were treated with nothing. Doublesided adhesive tape was used to fix the root slices to the bottom of wells in a 48well tissue culture plate. The treated and untreated root slices were then sterilized under UV light for 2 hours prior to seeding with cells .The culture were allowed to attach for 24 or 48 hours using standard incubation conditions. The attached and proliferated cells were visualized using MTT staining. Results: The untreated root surfaces demonstrated the least number of attached cells. The root surfaces treated with EDTA or PRP alone all significantly increased cell attachment(P<0.05). When PRP were added to previously EDTAetched root surfaces, cell attachment was further enhanced (P<0.01). Diseased root surfaces untreated with EDTA or PRP did not enhance cell proliferation. cell proliferation onto diseased root surfaces treated with EDTA or PRP alone was slightly increased (P>0.05). When PRP were added to previously EDTAetched root surfaces, cell proliferation was also enhanced.(P<0.05). Conclusion: Freshly prepared PRP or EDTA could effectively enhance the attachment and proliferation of human periodontal ligament fibroblasts onto human diseased root surfaces.

　　[KEY WORDS] Plateletrich plasma; Periodontal ligament fibroblasts; Attachment; Proliferation

　　牙周病患牙根面存在各种毒素已成共识，根面平整、脱矿处理可有效地去除病变根面上的内毒素、残留致炎物质等玷污层，从而有利于细胞附着、生长，促进新附着的形成。枸橼酸、四环素及各种生长因子等可用于根面处理，但临床应用研究发现根面用pH值为1的枸橼酸处理并无更多的新附着形成[1]。富血小板血浆(plateletrich plasma,PRP)含有丰富的生长因子，以转化生长因子β(TGFβ)和血小板源性生长因子(plateletderived growth factor，PDGF)含量较高，能促进体外培养的牙周膜成纤维细胞和成骨细胞的增殖和胶原的形成[2]，Lekovic等[3]将PRP、牛骨粉联合应用治疗慢性牙周炎骨缺损患者，取得较好的效果，刘琪等[4]研究表明经PRP处理的生物降解膜能明显增强鼠牙周膜成纤维细胞的附着和增殖。但用EDTA和PRP处理牙周炎患牙的根面能否促进人牙周膜成纤维细胞(periodontal ligament fibroblast，PDLF)的附着和增殖，目前国内尚未见报道。本研究旨在观察PDLF 在EDTA脱矿和PRP单独及联合处理病变根面上的附着和增殖，为其在牙周治疗中的应用提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　选择年龄在12～30岁因正畸或阻生拔出的患牙，X线显示无根尖病变、无牙槽骨吸收且牙龈正常者做牙周膜成纤维细胞的培养;选择因重度牙周病拔除的患牙制备牙根片。

　　1.2 方法

　　1.2.1 牙周膜成纤维细胞的培养 收集附着在牙根面的牙周膜组织，将其剪成1mm×1mm大小,移入25mL的培养瓶内,加入少量的含20%小牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、20 mmol/L Hepes的DMEM培养液,将培养瓶直立于37℃、5%CO2饱和湿度的孵箱内，4～8 h后倒瓶，使培养液充分浸没组织块，3 d换液1次，直至传代，待细胞贴满瓶底80%左右时即行传代培养，取第5～8代细胞用于实验。

　　1.2.2 牙周炎患牙牙根片的制备 牙齿拔除前标记釉牙骨质界至牙周袋底的区域,即牙周病累及的根面区，拔除过程中注意不损伤根面，拔除后用生理盐水冲洗，用刮治器刮净附在根面上的物质，在冷水冷却的条件下用金刚砂片将牙根磨成4 mm×4 mm大小、0.5 mm厚(只磨除牙本质侧，牙骨质侧不磨)的根片，经高压后置入DMEM培养液中浸泡48 h后待用。

　　1.2.3 PRP的制备[5] 取新鲜全血(已加入抗凝剂)经2次离心提取PRP，第1次1 300 r/min离心10 min，吸取全部上清液及交界面以下1～2 mm的红细胞至另一离心管,弃去下层的红细胞，再次2 000 r/min离心10 min，下层为PRP，将PRP保存在-20℃冰箱待用，制作全过程严格无菌。

　　1.2.4 细胞计数实验 实验分为脱矿组(24%的EDTA处理2 min，DMEM冲洗3遍后自然干燥)和未脱矿组(将准备好的根片直接用于实验)，脱矿和未脱矿的根片再分别用或不用PRP包被。将脱矿和未脱矿的根片用3 mm×3 mm的双面胶固定在48孔板中，每组设3个样本，放入超净台中紫外光照射2 h，实验组根片包被20 μL的PRP,对照组不包被PRP，操作时保持无菌，取5～8代的牙周膜成纤维细胞，调整细胞浓度为3×104/mL,将细胞以每孔500 μL接种于含根片的48孔板中，再于每孔中加入含2%FBS的DMEM培养液500 μL，CO2孵箱内标准环境下培养24 h。24 h后取出48孔板，用小镊子小心夹出根片放入另一块有PBS液的48孔板中轻轻漂洗后放入一洁净的96孔板中，每孔加入200 μL的0.125 g/L的胰蛋白酶消化5 min，吸出消化液放入1.5 mL的EP管中，将根片用不含FBS的DMEM培养液400 μL反复冲洗3遍，冲洗液均收集于EP管中，将收集到根片上附着细胞的EP管以800～1 000 r/min离心5 min，弃上清液，将收集到的细胞悬浮在200 μL的培养液中，用血细胞计数板计数根片上所附着的细胞数，换算出每平方毫米根片上的细胞数。

　　1.2.5 四甲基偶氮唑盐(MTT)比色实验 根片固定和处理同细胞计数实验，每孔接种细胞1.5×104个，分别于24 h和48 h后取出根片轻轻漂洗去除根面未附着的细胞，每孔加入200 μL 0.125 g/L的胰蛋白酶消化5 min，吸出消化液放入另一洁净的48孔板中，将根片用不含血清的DMEN培养液反复冲洗3遍，冲洗液收集到一洁净的48孔板中，每孔中加入MTT液20 μL后将48孔板放入CO2孵箱内标准环境下孵育，4 h后取出48孔板于每孔中加入150 μL的二甲基亚砜不断震荡15min后放入ELX800酶联免疫检测仪中读取光密度值。

　　1.3 统计学处理

　　采用SPSS11.0软件对数据进行分析，计量资料的比较采用单因素方差分析(oneway analysis of variance,ANOVA)，检验水准a=0.05。

　　2 结果

　　2.1 细胞计数实验结果

　　未处理组、单纯脱矿组、单纯PRP组、脱矿PRP组PDLF对病变根面的附着数分别为(251.74±15.03)、(312.50±26.04)、(347.22±30.07)、(485.96±29.81)细胞/mm2(24 h)，单纯脱矿组、单纯PRP组、脱矿PRP组均明显高于未处理组，差异有统计学意义(P<0.05～0.01)。

　　2.2 MTT实验结果

　　未处理组牙周膜成纤维细胞48 h的OD值明显低于24 h的OD值(P<0.05)，脱矿PRP组48 h的OD值明显高于24 h的OD值(P<0.05)。不同处理组牙周膜成纤维细胞增殖的时间效应注：同组间与24 h的OD值相比，*P<0.05。

　　3 讨论

　　用酸性药物对根面平整后的病变根面进行脱矿处理是临床牙周手术中常用的根面处理方法，用于根面处理的物质还有多种，如用四环素类药物或各种生长因子(如TGFβ和PDGF)等处理根面，还有将釉基质蛋白用于临床牙周手术中取得了再生的效果。研究表明用EDTA处理根面是一种有效的获得牙周组织再生的方法[6]。PRP因含多种生长因子,其促进牙周再生和修复的的作用日益受到学者们的重视, Kawase等[7]研究表明来源于PRP的纤维蛋白能促进体外培养的牙周膜成纤维细胞和成骨细胞的胶原合成。本实验中牙周病累及的病变根面未经处理，细胞的附着数较处理组明显减少，且随着时间的延长，细胞不但不增殖反而下降，经EDTA处理后再用PRP包被，牙周膜成纤维细胞的附着和增殖明显增强，分析原因可能为既有EDTA去除了玷污层，中和了毒素，消除了残留的毒素对细胞的抑制作用，同时又有PRP中生长因子的促增殖效应，可以推测PRP中的生物活性因子具有促牙周膜成纤维细胞附着和生长的潜能。关于PRP促进牙周再生的确切机制以及PRP在牙周治疗中应用的可靠性仍需进一步研究。

　　【参考文献】

　　1 孟焕新.牙周病学[M].第3版.北京：人民卫生出版社，2008.268.

　　2 Okuda K , Kanase T , Momose M , et al . Plateletrich plasma contains high levels of plateletderived growth factor and transforming growth factorbeta and modulates the proliferation of periodontally related cells in vitro[J] .J Periodontal,2003 , 74(6) : 849857 .

　　3 Lekovic V , Camargo PM , Weinlaender M , et al . Comparison of plateletrich plasma , bovine porous bone mineral, and guided tissue regeneration versusplateletrich plasma and bovine porous bone mineral in the treatment of intrabony defects : a reentry study[J]. J Periodontol,2002,73(2):198205 .

　　4 刘琪,Victor M, Mark B. 新型牙周再生细胞传递载体的体外建立[J].华西口腔医学杂志,2006,22(1):1518.

　　5 Gonshor A.Technique for producing plateletrich plasma and platelet concentrate: background and process[J].Int J periodontics Restorative Dent, 2002,22(6):547557.

　　6 Sculean A, Donos N, Brecx M, et al. Treatment of intrabony defects with guided tissue regeneration and enamelmatrixproteins. An experimental study in monkeys[J].J Clin Periodontol,2000 ,27(7):46672.

　　7 Kawase T, Okuda K, Wolff LF, et al. Plateletrich plasmaderived fibrin clot formation stimulates collagen synthesis in periodontal ligament and osteoblastic cells in vitro[J]. J Periodontol,2003,74(6):85864.