肾康丸对糖尿病肾病大鼠TGF-β1/Smad信号通路的影响

　　作者：肖炜1,马云2　　作者单位：南方医科大学:1中医药学院中医内科研究室,2南方医院药局药材科,广州510515

　　摘要:目的　探讨肾康丸对糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)大鼠TGF-β1/Smad信号通路影响。方法　用链脲佐菌素(STZ)腹腔注射法诱导建立大鼠糖尿病(diabetesmellitus, DM)模型,模型成功后随机分为3组:模型对照组、开搏通组、肾康丸组,另设正常对照组,治疗8周后,取大鼠肾脏,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法观察各组大鼠肾脏组织纤连蛋白(fibronetin, FN)和TGF-β1mRNA基因表达情况;采用免疫组化法观察各组大鼠肾脏组织Smad 2、Smad 3蛋白表达的情况。结果　在治疗的8周里,模型组大鼠血糖均维持在16. 7 mmol/L以上;出现多饮、多食、多尿、消瘦的DM症状; 8周后,DN模型组大鼠与正常大鼠比较,肾脏组织中FN和TGF-β1 mRNA基因表达显著上调(P<0•01), Smad 2、Smad 3蛋白表达明显增加。肾康丸和开搏通都可以抑制DN大鼠肾脏组织中FN和TGF-β1 mRNA基因表达,差异具有统计学意义(P<0•01),都可以减少Smad 2、Smad 3蛋白的表达。结论　肾康丸可以抑制DN大鼠肾脏中TGF-β1/Smad信号转导通路的激活,减少细胞外基质合成和分泌,从而延缓DN进程。

　　关键词:肾康丸,糖尿病肾病;TGF-β1/Smad信号通路

　　Abstract:Objective　To explore themechanism of Shenkangwan in preventing the development of dia-betic nephropathy(DN)through TGF-β1/Smad signaling pathway.Methods　The diabetic ratmodelswereestablished by intraperitoneal injection of streptozotocin(STZ)inmaleW istar rats and randomly divided into 3groups:model control group,Capoten group and Shenkangwan group. Another 8 normalW istar rats served asnormal contro.l After the rats had been treated for 8 weeks,the mRNA expressions of fibronetin(FN)andTGF-β1 were detected byRT-PCR and the protein expressions ofSmad 2,Smad 3 by immunohistochemistry inthe renal tissues.Results　During the past8 weeks,the blood glucose of the rats in themodel control groupwas all over16. 7 mmol/L and they exhibited the symptoms ofdiabetesmellitus,such as excessive thirsty,ex-treme hunger,frequenturination and unusualweight loss. ThemRNA expressions ofFN andTGF-β1 in rat re-nal tissues ofmodel control groupwere significantly higher than those in the rats ofnormal control group(P<0•01),accompanied by the increased quantity of the cells positive of Smad 2 and Smad 3 in their kidneys.Comparedwithmodel control group,themRNA expressions ofFN and TGF-β1 aswell as the protein expres-sions ofSmad 2 and Smad 3 in the ratkidney tissues ofShenkangwan and capoten groupswere significantly de-creased(P<0•01).Conclusion　Shenkangwan can restrain the activation ofTGF-β1/Smad signaling path-way and reduce the synthesis and secretion of extracellularmatrix in the renal tissues ofDN rats,whichwouldconduce to postphone the developmentofDN.

　　Key words:Shenkangwan;diabetic nephropathy;TGF-β1/Smad signaling pathway

　　糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病(diabetesmellitus,DM)患者临床常见而难治的微血管并发症,是导致终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)和DM患者死亡的主要原因[1]。如何有效预防DN发生,或阻断病情发展,延缓慢性肾衰进程,已成为当今国际医学界研究的重要课题。肾康丸作为医院制剂,在临床治疗DN患者多年,疗效确切。临床观察和动物实验研究都表明,该药在一定程度上可改善DN一般症状,保护肾脏,延缓DN的进展[2, 3],但其具体作用机制还不清楚。转化生长因子β1(transforminggrowth factor-β1,TGF-β1)通过自分泌与旁分泌途径,诱导肾小球及肾小管细胞肥大,促进细胞外基质(ex-tracellularmatrix, ECM)积聚,是DN发病过程中的重要因子[4]。近来发现的Smad蛋白是目前所知唯一的TGF-β受体胞内激酶底物,介导TGF-β1的胞内信号转导过程[5]。因此,本研究拟从TGF-β1/Smad信号通路出发,探讨了肾康丸治疗DN的分子机制,为其临床应用提供实验依据。

　　1　材料与方法

　　1. 1　实验动物

　　W istar雄性大鼠, 3月龄,体质量190~230 g,购于南方医科大学实验动物中心。

　　1. 2　受试药品和主要试剂

　　肾康丸,南方医科大学珠江医院药剂科生产(批号:20031214);开搏通片,上海中美施贵宝药业有限公司生产(批号: 0402032);链脲佐菌素(streptozocin, STZ)购自Sigma公司,TrizolRNA提取试剂购自北京鼎国生物科技有限公司,逆转录酶(AMV)购自Promega公司, OligdT18、Taq酶、dNTP、DNA标准、RNA抑制剂购自TaKaRa公司, Smad 2和Smad 3兔抗大鼠多克隆抗体购自Santa Cruz公司,即用型SABC(链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物)免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒购自Boster公司。

　　1. 3　主要仪器

　　One touch ultra血糖仪及其配套试纸购自美国强生公司,Biometra PCR扩增仪购自UNO-ThermoblockTM公司, UV-3000型紫外分析仪购自珠海黑马医学仪器有限公司, DYY-Ⅲ型电泳仪购自北京六一仪器厂,Bio-Rad SmartSpecTM3000型核酸蛋白定量分析仪购自Bio-Rad公司,RM2135型超薄组织切片机、DM-IRB型倒置显微镜、MPS30型照相机购自Leica公司。

　　1. 4　模型、分组给药与标本采集

　　按65 mg/kg腹腔内一次性注射STZ制作DM大鼠模型。STZ用枸橼酸钠缓冲液(0. 1 mol/L, pH 4. 5)配制。另设正常对照组(n=8)。连续喂养2周,测血糖、尿糖、尿量,若血糖值高于16. 7 mmol/L、尿糖(+++)以上、尿量增加1倍以上,则造模成功。造模成功后,随机分为3组:模型对照组,开搏通组和肾康丸组。开搏通组、肾康丸组分别按5 mg/kg、1. 2 g/kg(按照人与大鼠体表面积换算,分别相当于70 kg成人37. 5 mg/d、12g/d)灌服相应药物,连续8周。对照组灌服等容积生理盐水。末次给药后12 h,麻醉,取左肾, 10%甲醛中性缓冲液中固定,待做免疫组化检测;取右肾组织, PBS冲洗干净后,液氮冻藏,待提取组织mRNA。

　　1. 5　观察指标和测定方法

　　1. 5. 1　肾脏组织TGF-β1及FN mRNA的表达　　取100 mg左右肾组织剪碎,Trizol法提取总RNA。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性;核酸蛋白定量分析仪测D(260)、D(280),根据D(260) /D(280)值,判断RNA纯度。

　　RT-PCR反应:反应体系(25μl):MgCl24μ,l 5×Buffer5μ,l Rnase-freeH2O 9. 5μ,l dNTP(10 mmol/L) 1μ,l RNase In-hibitor0. 5μ,l反转录酶(AMV)2μ,l OligdT18 1μ,l RNA 2μl。反应条件:70℃,5min;42℃,60min;95℃,5min;4℃,10min;1个循环。PCR反应: TGF-β1正义链5′-AATACGTCAGACT-TCGGGAAGCA-3′,反义链5′-GTCAATGTACAGCTGCCGTACA-CA-3′, 498 bp; FN,正义链5′-ACCAACGCTCAGTCTCTACCTCCAA-3′,反义链5′-TTTGAGGTTTAGCGTATGCGGTGTC-3′,639 bp;β-actin,正义链5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAACAC-CCCAGCC-3′,反义链5′-AAGAGAGCCTCGGGGCATCGGAAC-CGCTCA-3′, 342 bp。引物由北京赛百盛公司合成。反应体系(50μl):三蒸水37μ,l 10×Buffer5μ,l dNTP(10 mmol/L)1μ,lcDNA 2μ,l TGF-β1(或FN)上、下游引物各1μ,lβ-actin上、下游引物各1μ,lTaq酶1μl。反应条件: 94℃, 5 min, 1个循环;94℃, 30 s, 60℃, 1 min, 72℃, 30 s, 35个循环; 72℃延伸10 min, 4℃。10μl反应产物于1. 5%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下检测、拍照,并用捷达801专业数码凝胶成像与分析系统分析各条带光密度值,结果以TGF-β1及FN与β-actin的光密度比值表示。

　　1. 5. 2　免疫组化法检测肾脏组织Smad 2和Smad 3蛋白的表达　　将肾组织投入10%甲醛中性缓冲液中固定24 h,将固定好的标本置于梯度酒精和二甲苯浸泡; 50~60℃浸蜡1~2 h,冷却,修块,切片,按实验分组编号,烤片(80℃, 2 h);常规脱蜡; 3%过氧化氢溶液进行抗原修复;滴加5% BSA封闭液,室温, 20 min;依次滴加Smad 2或Smad 3一抗、二抗后,与SABC结合;DAB显色;脱水,透明,中性树胶封片;在显微镜下观察、拍照。阴性对照:以PBS代替一抗,其余步骤同上述各步。

　　1. 6　统计学方法

　　数据用-x±s表示,采用SPSS 13. 0统计软件行单因素方差分析。

　　2　结果

　　2. 1　大鼠肾脏FN mRNA的表达

　　本实验中所提取RNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定, 28S、18S、5S清晰可见,D(260) /D(280)值在1. 8~2. 0,提示所提RNA完整,纯度较好。模型对照组大鼠肾脏FN mRNA的表达1565　　(1. 12±0. 16)较正常组(0. 56±0. 11)明显增加(P<0•01)。开博通(0. 91±0. 10)和肾康丸(0. 70±0. 17)治疗组均能显著降低造模后提高的FN mRNA的表达(P<0•01)。肾康丸组作用优于开搏通组(P<0•01)。M:标准;1:正常组;2:DN模型组;3:开搏通组;4:肾康丸 各组大鼠肾脏FN mRNA和TGF-β1 mRNA的表达

　　2. 2　大鼠肾脏组织TGF-β1 mRNA的表达

　　模型对照组大鼠肾脏TGF-β1 mRNA的表达(0. 372±0•055)较正常组(0. 183±0. 038)明显增加(P<0•01)。开博通(0. 303±0. 034)和肾康丸(0. 231±0. 059)治疗组均能显著降低造模后TGF-β1 mRNA的表达(P<0•01),肾康丸组作用优于开搏通组(P<0•01)。

　　2. 3　大鼠肾脏组织Smad 2、Smad 3蛋白表达情况

　　正常大鼠肾脏可见Smad 2、Smad 3蛋白表达的阳性颗粒,主要见于肾小球和肾小管,表达量较少。模型组在上述部位的Smad 2和Smad 3蛋白表达量明显增加,呈极强阳性表达,着色极深,说明DN大鼠肾脏Smad 2和Smad 3蛋白表达增强。各治疗组Smad 2和Smad 3在上述部位也有阳性表达,但明显轻于模型大鼠。

　　3　讨论

　　西医在治疗DN上除了主要控制高血糖、高血压、降低蛋白饮食及纠正脂代谢紊乱等对症处理外,最常用的治疗DN的药物是血管紧张素转换酶抑制剂(an-giotensin converting enzyme inhibitor, ACEI)类药物。ACEI能通过阻断AngⅡ的生成,在有效控制血压的同时,扩张肾小球出球小动脉甚于入球小动脉,以致小球内压力减低,蛋白滤出减少,对早期肾功能正常的DN患者,可使尿蛋白、尿转铁蛋白、尿内皮素排泄量均有明显降低。ACEI还能降低肾脏TGF-β1的合成,减轻氧化应激等,从多个环节延缓DN发生。所以本实验选择ACEI类的代表药物之一开搏通作为本次肾康丸

　　治疗DN实验研究的阳性对照药物。

　　DN与中医“消渴”中的肾消有关,自古医家多认为是肺、脾、肾三脏亏虚而致。在治疗上以益气健脾、滋阴补肾兼活血通络为法。肾康丸中以黄芪益气健脾;芡实、金樱子滋阴补肾固涩,滋而不腻;玉米须利尿泻热;水蛭等药活血通络,标本兼治。现代药理研究亦证实,黄芪具有双向调节血糖、降低尿蛋白等作用;玉米须、水蛭、益母草、山楂等药都能有效改善改善肾脏微循环,防止肾小球硬化,保护肾功能,减轻尿蛋白的排出等作用。前期的动物实验研究表明肾康丸可以改善DM大鼠的一般状态,降低血糖及GHb明显,减少Scr、BUN、Ccr、24 hUpro、24 hUalb,减轻大鼠肾脏组织病理损伤,保护肾功能,延缓肾损害进程,其具体作用机制尚待进一步研究。

　　TGF-β1在DN发病中的作用不容忽视。TGF-β1通过自分泌与旁分泌途径,诱导肾小球及肾小管细胞肥大,促进ECM积聚,是DN发病过程中的重要因子[4]。无论是在STZ诱发的DM大鼠的肾脏,还是在自发性DM大鼠(BB)以及自发性DM小鼠(NOD)的肾脏,TGF-β1 mRNA的表达和其蛋白质含量均明显升高,同时伴肾脏肥大和ECM增多[5]。

　　Smads家族蛋白是新近发现的参与TGF-β超家族在细胞内信号转导的一族蛋白质。迄今为止,在哺乳动物中已经分离鉴定的Smad蛋白有9种[5],用Smad1~9表示,按功能可分成3类:受体活化Smad(R-Smads)、共配偶体Smad(Co-Smad)和抑制性Smad(I-Smads)。R-Smads是专门转导TGF-β家族中某条信号通路的Smad,包括Smad 1~3、5、8、9,其中Smad 1、5、8、9参与BMP信号转导, Smad 2、3参与TGF-β信号转导。Co-Smad包括Smad 4,它是TGF-β族各类信号转导过程中共同需要的介质。I-Smads包括Smad 6、7,也可与Ⅰ型受体结合,结合反应的稳定性比受体激活型Smad更强,因而限制受体激活型Smad被磷酸化,抑制信号转导过程[5]。自发性OLETF大鼠DN模型(30周龄)与LETO正常大鼠比较,大鼠肾脏Smad 3含量及Smad 2、3表达均显著增加,并且与TGF-β1和FN表达量的增加相平行。而在OLETF大鼠尚未发生DM的12周时,两组大鼠的上述指标比较无显著差异,说明Smad蛋白表达在TGF-β1信号转导和DN发病中具有重要作用[6]。2型自发性糖尿病模型db/db小鼠与无糖尿病的db/m小鼠相比, TGF-β1、TβR-ⅡmRNA和蛋白水平在肾小球和肾小管表达明显增加,Smad 3以及Smad连接元素(Smad-Binding Elemen,tSBE)在细胞核的表达量显著增高,说明DM小鼠肾脏中TGF-β1系统在配体、受体、信号水平均有上调,存在TGF-β1/Smads信号通路的激活[7]。

　　激活的TGF-β1/Smad信号通路可以增加ECM中各种成分的表达,加速ECM进行性积聚,从而导致肾小球硬化。在TβR-Ⅱ表达降低的杂合型(heterozy-gous,HT)STZ至DM小鼠与TβR-Ⅱ正常的野生型STZ致DM小鼠相比, Smad2/Smad3表达减少,Ⅳ型胶原mRNA表达降低,说明降低TβR-Ⅱ的表达,下调Smad信号通路,可以减少ECM积聚[8]。本实验中, DN大鼠肾脏组织TGF-β1 mRNA表达水平均较正常组大鼠明显升高,受体活化性蛋白Smad 2和Smad 3的蛋白表达明显增加,同时FN mRNA的表达也明显增加。说明DN大鼠肾脏中整个TGF-β1/Smad信号通路都处于激活状态,从而使FN合成增加。肾康丸治疗后,可以抑制DN大鼠肾脏组织中TGF-β1 mRNA的表达,减少Smad 2和Smad 3蛋白的表达,抑制TGF-β1/Smad信号通路的激活,下调FN mRNA的表达,减少ECM的进行性积聚,从而延缓肾小球硬化和DN进程。

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