辛伐他汀对牙周组织再生的影响及意义

　　作者：王占义,胡东旭,李含薇　　作者单位：长春市口腔医院，吉林 长春

　　【摘要】目的 研究辛伐他汀(Sim)对牙周组织再生的影响和作用机制。方法 40只2月龄清洁级健康雄性Wistar大鼠，随机分为实验组和对照组，每组各20只，实验组每天Sim灌胃给药，连续灌注7 d。在上颌双侧磨牙区腭侧造牙周组织创伤模型，再给药7天。然后处死取上颌双侧第一、第二磨牙连同牙周软硬组织切片、原位杂交、染色、观察。结果 对照组破骨细胞数(4.78±2.12)个，而实验组(2.93±1.87)个(P<0.05);实验组牙周间充质细胞内TGFβ1 mRNA表达的细胞数为(15.36±2.25)个，多于对照组的(7.49±1.88)个(P<0.05);实验组中15例有活跃的成骨细胞，多于对照组的8例(P<0.05)。结论 Sim对牙周组织再生具有促进作用，可能通过上调TGFβ1 mRNA表达，促进牙周组织再生。

　　【关键词】 辛伐他汀;牙周组织再生;TGFβ1 mRNA

　　牙周病的理想治疗结果是牙周组织再生，形成牙周新附着。牙周再生是一个十分复杂，需要多种细胞类型、多种信号系统参与和调控的过程。为此，促进牙周组织再生的各种治疗方法和技术一直是研究的热点。体内外实验表明辛伐他汀(Simvastatin，Sim)进成骨细胞的分化、提高其BMP2、碱性磷酸酶mRNA的表达水平，并以时间和剂量依赖的方式促进骨组织的矿化〔1〕。由于牙槽骨与牙骨质的结构、组织来源与骨组织相似;牙周膜内存在牙周韧带细胞，牙周韧带细胞在牙周组织的再生中具有重要的作用，可分化为成纤维细胞、成牙骨质细胞和成骨细胞等。Yazawa等〔2〕观察了Sim与牙周韧带细胞间的关系，发现Sim能够在早期促进牙周韧带细胞的增殖并使其代谢轻度增加，推测Sim对牙周组织可能有影响。研究表明，肿瘤生长因子(TGF)β1能刺激骨形成前体细胞如骨膜细胞、骨髓间充质干细胞等的增殖分化〔3〕。局部应用 TGF  β1可促进骨折后骨痂的形成及提高骨痂的强度，刺激骨的内生长。因此，本实验通过检测TGF β1探讨Sim对牙周组织再生的影响，为进一步研究Sim对牙周组织的作用机制奠定形态学基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物和试剂 40只2月龄清洁级健康雄性(为避免激素水平变化对硬组织吸收的影响，只选雄性)Wistar大鼠，随机分为实验组和对照组，每组各20只。Sim由美国默克公司提供，TRAP染色试剂盒购自Sigma Aldrich(美国)公司。TGFβ1寡核苷酸探针序列为 5′CTCAGGCGTATCAGTGGGGGTCAGCAGC3′，购自天津灏洋公司。

　　1.2 实验方法 Sim溶解到 10 g/L羧甲基纤维素钠 (carboxymethylfibric sodium，CMCNa)溶液中，实验组每天 8：00以 Sim按10 mg/kg(体重)剂量灌胃给药，对照组灌以相同体积的CMCNa溶液，连续灌注7 d。第8天，2组动物均按说明书以0.5 ml/kg肌注速眠新全身麻醉后，固定于操作台上。参照Kaynak等方法，于上颌双侧磨牙区腭侧造成牙周组织创伤〔4〕。手术第2天继续以Sim 10 mg•kg-1•d-1剂量连续 7 d灌胃，对照组灌以相同体积的CMCNa溶液。术后第8天，大鼠全麻下行心脏灌注固定术。立即切取上颌双侧第一、第二磨牙连同牙周软硬组织，左侧磨牙区获取的标本于40 g/L多聚甲醛中常温继续固定24 h，右侧磨牙区获取的标本于40 g/L多聚甲醛中4 ℃条件下继续固定24 h。

　　1.3 组织学观察 左侧磨牙区获取的标本采用10%EDTA逐层脱钙，常规制备4 μm厚的颊舌向牙及牙周组织联合切片，做HE染色和原位杂交检测。右侧磨牙区获取的标本常规做冰冻切片后按照说明书进行TRAP染色。光镜观察并参照Kaynak等〔4〕方法，观察破骨(或牙)细胞的数目：记数破骨(或牙)细胞的数目;牙槽骨内成骨细胞的数量、形态及成骨细胞活性：成骨细胞的活性状态由成骨细胞的形成面即骨形成表面决定，其定义为在新形成未矿化的骨基质表面有相邻的骨样或立方样成骨细胞〔4〕。如果观察到该表面及相邻细胞为阳性，否则阴性。

　　1.4 原位杂交检测 操作步骤严格参照说明书进行。光镜下胞浆内呈棕黄色颗粒为阳性染色，蒸馏水终止反应，苏木素复染。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。每个标本随机选取3张切片，每张切片于40倍物镜下随机选取5个视野，记取阳性细胞总数，求取平均每个高倍视野的阳性细胞数。

　　1.5 统计学处理 两组之间配对比较采用χ2检验，两组之间均数的比较采用t检验。

　　2 结 果

　　对照组的牙周组织切片炎症细胞浸润较实验组多;实验组牙周膜内胶原纤维的数量较对照组明显增多，尤其是呈一定方向平行及斜行排列的胶原纤维，且纤维之间有新生血管，纤维束排列也比较致密有序。实验组较对照组有更多的新生牙槽骨形成。新形成的牙槽骨矿化程度较低，沉积于原有的牙槽骨表面，其中可见较多成骨细胞，部分标本有骨岛形成。对照组破骨细胞数量是(4.78±2.12)个，而实验组则是(2.93±1.87)个，组间有显著的统计学差异(P<0.05);实验组牙周间充质细胞内 TGF β1 mRNA表达的细胞增加，多于对照组，差异有统计学意义(见。对照组有8例在未矿化的骨基质表面有立方样成骨细胞，即活跃的成骨细胞，而实验组有15例有活跃的成骨细胞，差异有统计学意义(P<0.05)。各组破骨细胞数及TGFβ1 mRNA阳性表达细胞数

　　3 讨 论

　　Mundy〔1〕等发现Sim在体内可以促使新骨增加，同时使体外培养的成骨细胞内BMP2的基因表达增强，所以认为合适剂量的Sim可以治疗骨质疏松。随即一系列的研究证明了他们的推测〔5〕。本文发现Sim可使牙周组织炎症细胞浸润程度减轻，炎症细胞的数量明显减少，并且实验组与对照组之间胶原纤维的数量和排列程度差异也具有统计学意义，从体内证实Sim对牙周组织的炎症具有明显抑制作用，这与Sakoda的对上皮细胞的研究结果一致〔6〕。

　　Sim不仅可以促进皮质骨的再生，抑制松质骨的吸收，而且对破骨细胞的数量和活性具有明显影响，尤其是明显抑制破骨细胞活性〔7〕。实验表明，Sim可减少破骨细胞的数量，但其对破骨细胞活性的作用结果及其机制尚需要进一步研究探讨。

　　本文发现实验组的未分化间充质细胞和新生骨周围的成骨细胞 TGFβ1 mRNA表达明显强于对照组。可能是由于随着Sim逐渐释放，诱导未分化的间充质细胞分化为成骨细胞并促进骨形成相关细胞进一步表达TGFβ1 mRNA，所以在实验组可见新骨较多，周围成骨细胞较多，并且表达TGFβ1 mRNA的细胞多，而上调的TGFβ1 mRNA表达TGFβ1又进一步刺激成骨细胞增殖和基质蛋白的合成，表现为实验组骨形成明显。

　　Sim灌胃给药促进大鼠牙周组织再生，抑制牙根及牙槽骨的吸收，其促进成骨对于牙周治疗等领域有潜在的应用价值。

　　【参考文献】

　　1 Mundy G，Garrett R，Harris S,et al.Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins〔J〕.Science,1999;286 5446:19469.

　　2 Yazawa H，Zimmermann B，Asami Y,et al.Simvastatin promotes cell metabolism，proliferation，and osteoblastic differentiation in human periodontal ligament cells〔J〕.J Periodontol,2005;762：295302.

　　3 Bolander ME.Regulation of fracture repair by growth factors〔J〕.Proc Soc Exp Biol Med，1992;200：165.

　　4 Erdemli B，SerinKilicoglu S，Erdemli E. A new approach to the treatment of osteoporosis〔J〕.Orthopedics，2005;28(1):5962.

　　5 Oxlund H，Troels T.Andreassen Simvastatin treatment partially prevents ovariectomyinduced bone loss while increasing cortical bone formation〔J〕.Bone，2004;(34)：60918.

　　6 Sakoda K，Yamamoto M，Negishi Y，et al.Simvastatin decreases IL6 and IL8 production in epithelial cells〔J〕.J Dent Res，2006;85(6):5203.

　　7 Jadhav SB，Jain GK，et al.Statins and osteoporosis：new role for old drugs〔J〕.J Pharm Pharmacol，2006;58(1):31.