Livin和PCNA在口腔鳞癌浸润前沿中的表达和临床意义

　　作者：李向新1,蒋蕾1*,白玲2,张来健1　　作者单位：1.连云港市第一人民医院口腔科，江苏连云港222000;2.连云港市第一人民医院病理科

　　【摘要】目的检测凋亡抑制蛋白Livin和增殖细胞核抗原(PCNA)在口腔鳞癌浸润前沿和非前沿中的表达，探讨其在口腔鳞癌发生发展过程中的意义及两者相关性。方法对48例口腔鳞癌浸润前沿和非前沿部分分别进行病理分级，应用免疫组化Max-VisionTM快捷二步法检测Livin和PCNA在口腔鳞癌浸润前沿及非前沿部分的表达情况，并进行统计学分析。结果48例口腔鳞癌浸润前沿和非前沿病理分级情况有显著性差异(P<0.01);Livin和PCNA在浸润前沿中的表达强度明显高于非前沿部分(P<0.01);Livin表达阳性的口腔鳞癌组织PCNA标记指数(LI)高于Livin表达阴性者(P<0.01)，Livin的表达与PCNA呈正相关(rs=0.398,P=0.016)。 结论口腔鳞癌浸润前沿肿瘤细胞凋亡抑制现象和增殖活性明显高于非前沿部分。浸润前沿中Livin和PCNA的高表达可以反映肿瘤的高恶性度和高复发转移倾向。

　　【关键词】 口腔肿瘤;鳞状细胞癌;浸润前沿;Livin;增殖细胞核抗原

　　Abstract: ObjectiveTo detect the expression of apoptosis inhibitor livin and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) at the invasive tumor front of oral squamous cell carcinoma, and investigate the clinical significance of livin and PCNA in the pathogenesis and progression of oral squamous cell carcinoma and their correlations. MethodForty-eight samples of oral squamous cell carcinoma were graded by invasive front grading (IFG) into invasive tumor front (ITF) and non-invasive tumor front (non-ITF)in pathology. The expression of livin and PCNA in both ITF and non-ITF was evaluated by two-step method of the rapid immunohistochemical staining (Max-VisionTM) and the results were analyzed statistically. ResultThere were significant differences in the ITF and non-ITF of oral squamous cell carcinoma as for the grading (P<0.01). The expression of livin and PCNA at the ITF was stronger than that of the non-ITF (P<0.01). The labeling index (LI) of PCNA in the positive group of expression of livin was higher than that in the negative group (P<0.01). The expression of livin was positively correlated with PCNA (rs=0.398,P=0.016). ConclusionThe apoptosis inhibition and proliferation of the tumor cells at the ITF in oral squamous cell carcinoma were more significant than at the non-ITF. The high expression levels of livin and PCNA at the ITF may indicate the trend of high malignancy, recurrence and metastasis.

　　Key words： oral neoplasms; squamous cell carcinoma; invasive tumor front; livin; proliferating cell nuclear antigen

　　肿瘤的发生是细胞增殖与凋亡失衡所致，凋亡抑制是肿瘤发生的重要机制。而肿瘤的浸润是肿瘤的某些物质或细胞在质和量方面异常分布于组织间隙的现象[1]，是肿瘤实现远处转移的第一个步骤。浸润前沿是指位于肿瘤与宿主组织或器官交界处最前沿的3~6层肿瘤细胞或分散的细胞团。研究肿瘤浸润前沿细胞的生物学特性对于客观评估肿瘤的预后有重要意义。Livin是最近发现的凋亡抑制蛋白家族中的新成员，可能在肿瘤的发生和发展中起重要作用。我们将凋亡抑制蛋白Livin和增殖细胞核抗原(PCNA)同时引入口腔黏膜鳞癌的研究，以期能了解其在肿瘤发生发展中的作用。

　　1材料和方法

　　1.1标本来源选择徐州医学院附属连云港市第一人民医院口腔科2001—2008年手术切除并经病理证实为口腔黏膜鳞癌标本48例，所有病例术前均未接受过放化疗等特殊抗肿瘤治疗。其中男29例、女19例，年龄36~79岁,平均58.2岁;组织来源于舌23例,颊5例,口底3例,牙龈10例,腭7例;有局部淋巴结转移6 例，无转移42例;Ⅰ期6例，Ⅱ期14例，Ⅲ期16例，Ⅳ期12例。选择距肿瘤1.5 cm以上病理证实为阴性的口腔黏膜组织作为正常对照。

　　1.2主要试剂及仪器兔抗人Livin多克隆抗体购自武汉博士德公司(BA1743)，工作浓度1∶100;鼠抗人PCNA单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司，为即用型;Max-VisionTM试剂盒和DAB显色剂均购自福州迈新生物技术有限公司。仪器：普通实验室冰箱、切片机、烤片机、高压锅、温育箱、湿盒、恒温振荡器、Olympus BX41显微镜、显微数码照相机Olympus BX40F4、PAS900图像分析系统等。

　　1.3方法对已有苏木精-伊红染色切片进行组织学观察，对浸润前沿及非前沿部位分别进行组织病理分级。免疫组化方法：常规石蜡制片，切片厚度3~4 μm，采用免疫组化Max-VisionTM快捷二步法检测Livin、PCNA蛋白的表达，严格按试剂盒说明书进行操作。

　　1.4结果判定Livin表达主要位于细胞质，以出现清晰的棕黄色颗粒作为阳性结果判定，综合考虑切片中阳性细胞占所观察同类细胞数的百分比及显色程度。阳性细胞百分比分为4级：≤5%为0分;6%～25%为1分;26%～50%为2分;≥51%为3分。根据显色程度判定阳性强度：基本不着色为0分;淡黄色为1分;棕黄色为2分;棕褐色为3分。将每张切片着色程度得分与着色细胞百分率得分相乘，为最后得分。0～1分为阴性(-);2～3分为弱阳性(+);4～6分为中等阳性(++);6分以上为强阳性(+++)。PCNA表达定位于细胞核，出现清晰的棕黄色颗粒为阳性。采用PCNA标记指数(labeling index，LI)，即每例在镜下随机取4个区，每区分别计数200个细胞的阳性细胞率，取均值作为LI，来进行计算。

　　1.5统计学处理应用SPSS 17.0软件进行统计分析。进行配对设计的秩和检验和t检验，两者相关性采用Spearman等级相关分析。P<0.05为差异有显著性。

　　2结果

　　2.1组织学观察光镜下同一标本不同部位细胞分化程度存在差异，位于浸润前沿的肿瘤细胞通常具有低分化、高离散的特征，与中心或近表面部分的肿瘤细胞相比，浸润前沿的组织分化较非前沿部分差(图1)。浸润前沿和非前沿病理分级差异有显著性(P<0.01)，浸润前沿的组织分化较非前沿部分差(表1)。图1口腔鳞癌浸润前沿和非前沿的组织学观察(苏木精-伊红染色，×200)A.非前沿;B.浸润前沿表1口腔鳞癌浸润前沿和非前沿病理分级

　　2.2Livin蛋白的表达Livin 蛋白主要定位于细胞质, 阳性染色为粗细均一的棕黄色颗粒。本实验中所有正常口腔黏膜均为阴性表达，48 例口腔鳞癌组织在浸润前沿Livin的表达强度明显高于非前沿部分(图2)，差异有显著性(P<0.01，表2)。　　图2Livin在口腔鳞癌浸润前沿和非前沿中的表达(Max-VisionTM染色，×200)A.非前沿;B.浸润前沿表2Livin在口腔鳞癌浸润前沿和非前沿的表达

　　2.3PCNA蛋白的表达PCNA表达阳性是细胞核中出现棕黄色颗粒,正常对照组的口腔黏膜表达为阴性或仅在基底层见少量阳性细胞，48 例口腔鳞癌组织中PCNA 在浸润前沿的表达明显高于非前沿部分(图3)，差异有显著性(t=9.123，P<0.01，表3)。图3PCNA在口腔鳞癌浸润前沿和非前沿中的表达(Max-VisionTM染色，×200)A.非前沿;B.浸润前沿表3PCNA在口腔鳞癌浸润前沿和非前沿的表达

　　2.4Livin和PCNA蛋白表达的相关性分析Livin 蛋白表达阳性的口腔鳞癌组织中PCNA LI 高于Livin 蛋白表达阴性者 ( t=6.357，P<0.01，表4)，且PCNA LI 随Livin表达的增强而增高，Livin和PCNA蛋白的表达呈正相关(rs=0.398,P=0.016，表4)。表4口腔鳞癌中livin与PCNA表达的关系

　　3讨论

　　肿瘤的发生是细胞增殖与凋亡失衡所致,受细胞内外多种因素控制。 Livin是最近发现的凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis,IAP)家族成员，它与Survivin具有相似的、较强的抗凋亡活性，它的过度表达引起的凋亡不足与肿瘤发生密切相关。已有研究证实其在多种恶性肿瘤组织如黑色素瘤、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、脑星形细胞瘤、乳腺癌[2-9]等中表达。PCNA存在于细胞核中，在细胞增殖及DNA合成中起重要作用，它作为DNA 聚合酶的辅助蛋白，直接参与细胞增殖过程中的DNA复制[10]，含有增殖细胞的组织，可检出PCNA的阳性表达，而处于静止状态的细胞PCNA则为阴性表达，因此PCNA 的表达可以反映细胞的增殖活性。本实验将Livin和PCNA同时引入了口腔鳞癌的研究，以期了解两者的相关性及临床意义。

　　浸润是某些物质或细胞在质和量方面异常分布于组织间隙的现象[1]，肿瘤的浸润是肿瘤向周围正常组织获取营养并不断侵蚀周围组织屏障的过程, 是肿瘤实现远处转移的第一个步骤。浸润前沿的组织病理学、分子病理及癌细胞与间质之间的相互作用与中心或近表面部分不同，能更好地反映口腔黏膜癌的生物活性。许多学者研究发现，肿瘤的预后与浸润前沿细胞的生物学特性密切相关，可以对肿瘤的预后予以反馈。Bryne[11]认为该部分肿瘤细胞较之近表面部分肿瘤细胞分化更差，其形态和功能特征可更准确地反映肿瘤的生物多形性及侵袭性。

　　本实验中，口腔鳞癌在浸润前沿和非前沿部分在组织学方面和细胞分化程度上有明显不同，浸润前沿肿瘤细胞较肿瘤中心或近表面的细胞分化差。统计学分析显示：浸润前沿和非前沿部分的病理分级差异存在显著性，与赵尔扬等[12]的研究结果一致。口腔鳞癌的病理分级是判断肿瘤恶性度高低及预后的重要指标，而浸润前沿部分虽然对整个肿瘤来说所占比例小，但由于其与正常组织发生直接联系，对肿瘤的浸润、转移有着不可取代的意义。

　　实验证实Livin在前沿部分的表达多为阳性及强阳性，前沿部分Livin蛋白的表达强度较非前沿部分高，差异有显著性，提示在浸润前沿中肿瘤细胞凋亡抑制更为明显。实验中PCNA在肿瘤浸润前沿部分的表达显著高于非前沿部分， PCNA在浸润前沿聚集，说明浸润前沿是口腔黏膜鳞癌细胞增殖最活跃、分化最差的部位，肿瘤更具有高增殖性和侵袭性。浸润前沿部分较瘤体部分更能反映肿瘤的预后。我们的实验提示Livin和PCNA可作为口腔黏膜鳞癌的预后指标之一，检测浸润前沿中Livin和PCNA的表达可用于判断其恶性程度及预后。

　　Livin 蛋白表达阳性的口腔鳞癌组织中， PCNA LI高于Livin 蛋白表达阴性者，而Livin 蛋白阳性表达越强，PCNA LI也越高，统计学分析证实Livin 蛋白表达与PCNA LI呈正相关，提示Livin 可能一方面直接抑制细胞凋亡，另一方面通过促进细胞的有丝分裂、增强细胞增殖活性，使细胞无限增殖而导致恶性肿瘤的发生、发展[13]。

　　实验提示，口腔鳞癌上皮细胞中凋亡抑制蛋白Livin 和PCNA 的表达反映了细胞增殖与细胞凋亡平衡失调，其阳性率增高与口腔鳞癌的发生、发展密切相关。Livin和PCNA可作为口腔黏膜鳞癌的预后指标，检测浸润前沿中Livin和PCNA的表达可用于判断其恶性程度及预后。

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