成人正畸患者龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌的变化

　　作者：陆卉1 周慧敏2 宋晓波3 孙境庐3 刘红彦1 作者单位：1.大连医科大学附属第一医院 口腔正畸科，辽宁 大连 116011;2.大连医科大学 微生物教研室，辽宁 大连 116000;　3.特隆姆瑟大学 医学微生物系，挪威 特隆姆瑟 9037

　　【摘要】 目的 研究成人正畸患者在固定矫治器戴入后，其牙周临床指标和龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)的早期变化。方法 选择成人正畸患者11例，分别在矫治器戴入前，戴入后第1、3个月检查牙周临床指标(包括菌斑指数、龈沟出血指数、探诊深度和附着丧失)，同时采集龈下菌斑样本，利用荧光实时定量聚合酶链反应检测样本中P.gingivalis和总细菌的数量，计算出P.gingivalis的检出率和构成比。分析牙周临床指标和P.gingivalis的检出率、构成比在不同观察时点的变化情况。结果 菌斑指数、龈沟出血指数在矫治器戴入后均比戴入前明显升高(P<0.05)。探诊深度在矫治器戴入1个月后升高(P<0.05)，3个月后下降至基线水平。试验中未发现有探诊深度大于2 mm的患者，也未发现有附着丧失的患者。在3次检测中，P.gingivalis检出率均为45.5%，而P.gingivalis构成比的变化也无统计学差异(P>0.05)。结论 固定矫治器戴入早期可引发成人正畸患者口内局部菌斑堆积，菌群中P.gin-givalis增殖，出现轻度牙龈炎。

　　【关键词】 固定矫治，牙龈卟啉单胞菌，实时定量聚合酶链反应，牙周临床指标

　　Quantitative study of Porphyromonas gingivalis in subgingival plaques of orthodontic adults LU Hui1, ZHOU Hui-min2, SONG Xiao-bo3, SUN Jing-lu3, LIU Hong-yan1.(1. Dept. of Orthodontics, The First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116011, China; 2. Dept. of Microbiology, Dalian Medical University, Dalian 116000, China; 3. Dept. of Medical Microbiology, University of Tromso, Tromso 9037, Norway)

　　[Abstract] Objective To assess the early variation of clinical periodontal indexes and Porphyromonas gingivalis (P.gingivalis) in subgingival plaques of orthodontic adults. Methods 11 orthodontic adults were selected. Clinical periodontal indexes of observed teeth were examined at three different time points: Before orthodontic treatment, the first month after treatment and the third month after treatment, and subgingival plaques were collected simultaneously at each time point. Clinical periodontal indexes included four ones: Plaque index(PLI), sulcus bleeding index(SBI), probing depth(PD), and attachment loss. We used real-time quantitative polymerase chain reaction to detect and quantitate the number of total bacteria and P.gingivalis in each sample to obtain positive rate of P.gingivalis and the percentage of P.gingivalis in total bacteria. Results PLI and SBI of the first and third month were more than that of the baseline(P<0.05). PD rose at the first month after treatment(P<0.05), and then dropped at the third month. PD of all the 11 participants was lower than 2 mm. No attachment loss was found. The positive rate of P.gingivalis was stable(45.5%) and the proportion of P.gingivalis had no significant difference(P>0.05) at each time point. Conclu-sion Fixed orthodontic appliances caused plaque accumulation, accordingly slight gingiva inflammation and the increasement of P.gingivalis occurred in the early stage, but none periodontitis was found.

　　[Key words] fixed orthodontic treatment; Porphyromonas gingivalis; real-time quantitative polymerase chain reaction; clinical periodontal index

　　固定矫治可促进儿童正畸患者的菌斑堆积，使牙龈炎症加重。这一观点已在很多研究中得到证实。临床治疗中，成人正畸患者可能发生更加复杂的牙周问题，因此深入研究成人正畸患者的牙周微生物状况是十分必要的，可以为临床预防固定矫治过程中出现的牙周病变提供理论依据。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis)是证据充分的牙周致病菌之一，并与慢性牙周炎的关系最为密切[1]。本试验选择行固定矫治的成人患者为研究对象，利用荧光实时定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)研究患者龈下P.gingivalis数量的变化，同时检测牙周临床指标，以期较全面地揭示固定矫治器给龈下微生态环境带来的变化。

　　1 材料和方法

　　1.1 病例选择 选择2007年7-8月在大连医科大学附属第一医院口腔正畸科初诊的11例患者为研究对象。11例患者中，男2例，女9例;年龄18~25岁，平均年龄22.5岁。所有患者要求：1)无龋齿或龋齿已充填，无牙周病、口腔黏膜病;2)口腔卫生良好，无明显的口腔不良习惯;3)实验前1个月未服用抗菌药物或激素;4)患者同意参加试验且能按时复诊。试验过程中若不能按时复诊或服用抗生素则中途剔除。所有患者均采用直丝弓矫治技术进行矫治。第一磨牙戴带环，边缘置于龈上0.5~1.0 mm;其他牙粘接直丝弓托槽，托槽和带环均为不锈钢制(杭州新亚公司)。在正畸治疗开始前1周进行系统的口腔卫生宣教，教会患者使用正畸牙刷。要求患者采用Bass刷牙法，每次饭后刷牙。

　　1.2 牙周临床指标检测 在患者初诊时为每个患者建立牙周病历，在固定矫治器戴入前和戴入后第1、3个月分别检查牙周临床指标。选择下颌中切牙作为观察牙位，要求该牙齿的牙颈部无充填物。牙周检查由同一位临床医生完成。用牙周探针分别检测2个下颌中切牙唇侧近中、中和远中的菌斑指数(plaque index，PLI)、龈沟出血指数(sulcus bleeding index，SBI)、探诊深度(probing depth，PD)和附着丧失。计算2颗牙共6个位点的平均数作为该指标的检测结果。PLI采用Silness和L?觟e[2]提出的方法进行检测;SBI、PD和附着丧失根据《牙周病学》第2版描述的方法进行检测[3]。

　　1.3 P.gingivalis检测方法

　　1.3.1 龈下菌斑采集 在固定矫治器戴入前和戴入后第1、3个月分别采集龈下菌斑，检测牙周微生物状况。菌斑采集方法：隔湿唾液，去除龈上菌斑，用无菌Gracey刮治器采集2颗下颌中切牙唇侧近中至远中的龈下菌斑。将采集的菌斑放入1个盛有1 mL无菌生理盐水的无菌离心管中，作为患者的微生物样本。样本置于-70 ℃保存。

　　1.3.2 细菌DNA提取 取出保存的样品，室温下溶解，常规酚-氯仿抽提法提取细菌DNA，-20 ℃保存备用。

　　1.3.3 P.gingivalis检测 采用P.gingivalis ATCC33277作为标准菌株(四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供)，以通用菌16S保守序列作为内参，利用Taq man探针荧光实时定量PCR法对样本DNA进行检测，得出每个样本中P.gingivalis和总细菌的数量，从而可以得到P.gingivalis在不同样本中的检出率及其在总细菌中所占的构成比。

　　P.gingivalis检测方法如下。1)引物设计：本试验所用引物由日本Takara公司设计。分别在P.gin- givalis标准菌株ATCC 33277的16S和大肠杆菌16S保守序列上设计引物和探针，其序列见表1。2)标准曲线绘制：分别将通用菌和P.gingivalis标准品DNA按10倍梯度稀释作为模板，进行定量PCR，制作标准曲线(图1、2)。图1通用菌标准品的标准曲线 图2 P.gingivalis标准品的标准曲线 3)PCR反应条件：95 ℃，10 s;95 ℃，5 s，45个循环;60 ℃延伸30 s。

　　1.4 统计分析 利用SPSS 13.0软件进行统计分析，检验水准为双侧α=0.05。以患者戴入矫治器前测量的数据作为基线，对龈下微生物及牙周临床指标的检测结果进行统计学描述，并比较各指标在不同观测点的变化。患者在不同观测点的PLI、SBI、PD和附着丧失的变化，以及P.gingivalis构成比的变化采用多因素方差分析法进行分析;在不同观测点P.gingivalis检出率的变化采用卡方检验进行分析。

　　2 结果

　　2.1 牙周临床指标检测结果 牙周临床指标的检测结果见表2。与基线相比，PLI和SBI在戴矫治器后第1个月和第3个月后明显升高，其差异有统计学意义(P<0.05);但2个指标在戴矫治器后第1个月和第3个月之间的差异无统计学意义。与基线相比，PD在戴矫治器后第1个月上升，其差异有统计学意义(P<0.05);戴矫治器后第3个月，PD下降至基线水平。此外，在3次检测中，所有研究对象的PD均小于等于2 mm，且均未检测到附着丧失。

　　2.2 P.gingivalis检测结果 P.gingivalis检测结果见表3。由表3可见，在3次检测中，P.gingivalis的检出率均为45.5%，3次构成比的差异也无统计学意义(P>0.05)。该结果提示，P. gingivalis的检出率和构成比在正畸治疗的前3个月保持稳定。

　　3 讨论

　　本研究选取临床上较易发生牙龈炎的下颌中切牙作为观察对象。实验结果表明，治疗后第1、3个月PLI均比基线显著升高，而第1个月和第3个月之间无明显差异，说明戴矫治器后PLI升高，但没有明显的持续升高;SBI的检测结果也有同样的趋势。从3次检测情况看，PLI均较低，检测值最高的第3个月也仅为0.772，可能是由于成年人能够较好地维护自身口腔卫生所致。由此可见，成人正畸患者在戴用矫治器初期即出现牙龈炎症，但随后稳定下来，并没有继续加重。PD是衡量牙周健康的重要指标。在3个月的观察期内，11例患者下颌中切牙唇侧的PD均在健康范围之内(小于等于2 mm)，也未发现牙周附着水平的丧失。虽然第1个月的PD与基线相比有明显升高，但第3个月即下降到与基线相似的水平。有学者[6]发现，即使患者本身患有中度牙周炎，成人正畸患者在矫治初期的PD也没有明显变化。本研究初期PD的升高可能是由于牙龈轻度肿胀造成假性牙周袋所致，并不是附着丧失造成的牙周袋加深;而第3个月PD的恢复可能与患者口腔卫生意识和技巧加强有关。龈沟是维持牙周健康的重要环境，也是口腔生态区的主要滞留区之一。人类口腔中寄居着500多种细菌，其中定植在龈下的就有300多种[7]。这些细菌的种类和数量庞大，且多数为厌氧菌，与牙周组织的健康状况密切相关。牙龈卟啉单胞菌是公认的牙周可疑致病菌，与牙周炎的起始和进展密切相关。以往多采用培养法检测这些龈下细菌，但培养法耗时费力，敏感性和准确性也较低。利用凝胶电泳终点定量的PCR法，其结果也往往不够准确。本试验利用目前准确度较高的实时定量PCR法进行检测，以提高检测结果的准确性。本研究11例成人正畸患者，在戴入矫治器3个月内的P.gingivalis检出率无明显变化，提示固定矫治器在短期内并没有促进致病菌的定植。但是有报道[8]指出，与非治疗对照组相比，正畸治疗6个月以上患者的P.gingivalis检出率明显升高。本试验如果增加样本量，或者延长观察时间，也有可能得出更加明显的变化趋势。

　　Lyons等[9]提出，可以利用定量PCR方法计算P.gingivalis构成比来比较不同菌斑样本中P.gingivalis的数量。陈旭等[10]利用PCR产物凝胶电泳的灰度值进行分析，认为P.gingivalis对青春期龈炎的致病作用与其在龈下菌斑中的含量有关。在本试验中，随着观察时间的延长，P.gingivalis的构成比升高，虽然经统计学检验没有差异，但从数值上看，第3个月的数值为基线数值的7倍多。笔者推测，如果增加样本量，或者延长观察时间，可能会得出有统计学意义的结果。由此也可以看出，随着治疗时间的延长，正畸矫治器的存在在一定程度上改变了龈下微生物的生存条件，促进了龈下牙周致病菌的繁殖，为牙周疾病的发生发展创造了条件。

　　本研究结果表明，固定矫治器的戴入的确可以影响牙周的微生态和临床状况，但是在戴入早期还没有明显超出正常范围。长期戴固定矫治器可能导致的牙周状况的变化还有必要作进一步研究。

　　致谢：本研究得到北京大学口腔医院牙周科沙月琴教授的悉心指导，特此致谢!

　　【参考文献】

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　　3 曹采方. 牙周病学[M]. 2版. 北京： 人民卫生出版社, 2004：87-90.CAO Cai-fang. Periodontology[M]. 2nd ed. Beijing： People′sMedical Publishing House, 2004：87-90.

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　　9 Lyons SR, Griffen AL, Leys EJ. Quantitative real-time PCR forPorphyromonas gingivalis and total bacteria[J]. J Clin Microbiol,2000, 38(6)：2362-2365.

　　10 陈旭, 许学斌, 潘亚萍, 等. 青春期龈炎龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌的检测[J]. 上海口腔医学, 2005, 14(6)：635-638.CHEN Xu, XU Xue-bin, PAN Ya-ping, et al. Detection of Por-phyromonas gingivalis in the subgingival plaque of puberty gin-givitis[J]. Shanghai J Stomatol, 2005, 14(6)：635-638.