口腔常见链球菌代谢组学鉴定的研究

　　作者：郭强 肖丽英 周学东 李明云 鲁维希 熊萍 贾向明 李伟 作者单位：(口腔疾病研究国家重点实验室，四川大学;四川大学 分析测试中心，四川 成都 610041)

　　【摘要】 目的 通过比较血链球菌和远缘链球菌的代谢物图谱，初步将基于核磁共振的代谢组学方法应用于口腔常见链球菌的快速鉴定。方法 在液体TPY培养基中分别接种相同密度的血链球菌和远缘链球菌菌悬液，用比浊法测定菌悬液密度，绘制生长曲线。取2种细菌生长稳定期的培养液检测核磁共振图谱，进行主成分分析。结果 主成分分析表明2种细菌的数据内部具有集中的聚类关系，该方法可以区分这2种细菌。结论 代谢组学方法在口腔链球菌的快速鉴定中具有良好的应用前景。

　　【关键词】 代谢组学，核磁共振，细菌

　　Discrimination of common oral streptococcus with metabonomics method

　　GUO Qiang, XIAO Li-ying, ZHOU Xue-dong, LI Ming-yun, LU Wei-xi, XIONG Ping, JIA Xiang-ming, LI Wei.

　　(State Key Laboratory of Oral Diseases, Sichuan University, Chengdu 610041, China;Analytical and Testing Center, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

　　[Abstract] Objective To evaluate the feasibility of identifying oral streptococcus by comparing their metabolic profiling, and to find a convenient and rapid way to discriminate oral microorganisms. Methods The pure cultivation of Streptococcus sanguis ATCC 10556 and Streptococcus sobrinus 6715(reference strain) from solid culture were re-spectively inoculated in TPY liquid medium. Then the growth quantity was measured periodically by turbidimetry and the growth curves of the inoculated bacteria were completed. The culture solutions in the stationary phase of the two bacteria were centrifuged, and then tested with the 1H-nuclear magnetic resonance(1H-NMR) spectrometer respec-tively. The gained free induction decay(FID) data were all inputted into MestReC Soft and finally transformed intometabolic profiling. The metabolic profils were integrated segmentingly and the results were inputted into SIMCA-P Soft for principal components analysis(PCA). Results The PCA results showed the obvious clustering phenomenaand the points of two group data differentially centralized in two clusters. Therefore, the NMR-based metabonomics profiles can discriminate the two different kinds of bacteria. Conclusion The metabonomics can be expected to be a kind of promising useful method in quick discrimination of oral streptococcus.

　　[Key words] metabonomics; nuclear magnetic resonance; bacterium

　　代谢组学作为20世纪90年代中期诞生的一门研究生物体系受到内在和外在因素刺激产生内源性代谢变化的科学，在近10年的时间中取得迅速发展，并在诸如微生物和植物研究、药物毒性和机制研究、疾病诊断和动物模型、基因功能的阐明等领域展现出巨大的潜力[1]。与传统的基于表型或者基因型的微生物分类方法相比，代谢组学方法是一种快速、高通量、全面的表型分类方法，在鉴定微生物时操作简单并易获得微生物整体的细胞功能信息，可普遍应用于细菌及细菌生态学[2]。血链球菌(Stre-ptococcus sanguis，S.sanguis)和远缘链球菌(Strepto-coccus sobrinus，S.sobrinus)是人类口腔常见的链球菌，与龋病的发生关系密切。本实验的目的是通过分析比较血链球菌和远缘链球菌的代谢物图谱，尝试将基于核磁共振氢谱(1H-nuclear magnetic reso-nance，1H-NMR)[3]的代谢组学方法应用于这2种口腔常见链球菌的鉴定。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验菌株、实验仪器及试剂

　　血链球菌ATCC 10556和远缘链球菌6715(参考株)(四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供)。

　　CH-2生物显微镜(Olympus公司，日本)，比浊仪(Biored公司，美国)，MR1812高速低温离心机(Jouan公司，法国)，-80 ℃低温冰箱(Heto Ultra公司，美国)，DRX600核磁共振仪(Bruker BiospinRheinstetten公司，德国)。

　　TPY培养基：质量浓度15 g·L-1胰蛋白胨、4 g·L-1酵母提取物、10 g·L-1葡萄糖、6 g·L-1 KH2PO4、2 g·L-1 K2HPO4·3H2O、2 g·L-1 Na2CO3、2 g·L-1 NaCl、12.5 g·L-1琼脂。

　　1.2 生长曲线的绘制

　　血链球菌和远缘链球菌菌种经24 h复苏和1次24 h平板划线传代，并涂片检查及生化鉴定为纯培养后，接种于TPY液体培养基，在37 ℃，80%N2、10%CO2、10%H2的混合气体中孵育约15 h，用比浊仪测定浊度，调整菌悬液密度为1.5×108 CFU·mL-1。取42支试管，每支加入3 mL TPY液体培养基，其中21支加入50 μL血链球菌菌悬液，另外21支加入50 μL远缘链球菌菌悬液，置于80%N2、10%CO2、10%H2，37 ℃环境中培养。

　　在4、6、9、12、24、36、48 h分别取血链球菌和远缘链球菌各3管，用比浊仪测定菌悬液密度，并同时以纯TPY培养液为阴性对照。重复实验3次，取每个时间点的平均值，以时间(h)为横坐标，以菌悬液密度(CFU·mL-1)的对数值为纵坐标，经SPSS16.0统计软件绘制菌悬液密度随时间变化的生长曲线。

　　1.3 菌悬液的收集和处理

　　根据2种细菌的生长曲线确定其稳定期，分别取稳定期中段的菌液在高速低温离心机上以4 ℃，15 000 r·min-1离心10 min，再取上清液1 mL加入磷酸缓冲液，混匀后静置10 min。然后又以4 ℃，15 000 r·min-1离心10 min，取0.5 mL上清液加入重水0.25 mL，混匀后取500 μL移入已灭菌的核磁管，最后置于-80 ℃低温冰箱保存。测定NMR前取出，解冻并保持在0 ℃左右。

　　1.4 核磁共振图谱的采集和处理

　　采用德国Bruker公司的TXI探头，在超导傅立叶变换(Fourier transition，FT)NMR仪上调用ZGPR脉冲序列，谱宽7 288.63 Hz，采样点数64 K，叠加次数16次，饱和频率和中心频率都在水峰位置。所有样本的扫描温度设置为300 K，每个样本核磁扫描均收集到131 072个数据点，以D2O为溶剂，并以溶剂峰为内标，获得20个样本的原始自由感应衰减信号(free induction decay，FID)数据。将这些FID信号导入MestReC v4.9.9.6软件进行傅立叶转换得到原始的核磁共振图谱，再进行相位调整和基线调整以获得相位满意、对称性较好的1H-NMR图谱。

　　调用软件积分工具，移除水峰所在的4.5×10-6~6.5×10-6，以10.0×10-6到0.0×10-6为积分区域，0.04×10-6为一个积分区间进行分段积分，这样原来的积分区域被划分为199个积分区间(化学位移值段)，每一个区间进行积分后分别得到一个积分值，总共得到199个与积分区间对应的积分值。每个样品的1H-NMR图谱都进行同样的分段积分后，将所有的积分值导入到Excel文件中，就得到了一个n×d的二维矩阵，其中n为样本数20，d为积分区间数(化学位移值段数)199，即20×199的数据矩阵。保存存有积分值的Excel文件，用于主成分分析(principalcomponents analysis，PCA)。

　　1.5 主成分法分析数据

　　将存有积分值的Excel文件导入SIMCA-P(Umea公司，瑞典)v11.0软件，利用该软件对这个二维的积分矩阵进行主成分分析，以求出主成分(principal components，PC)，并以主成分矢量为坐标轴作二维得分图，从而对2组菌悬液的代谢组进行分析。

　　2 结果

　　2.1 生长曲线图

　　从图1可以看出，实验菌株在TPY培养基中分期生长特征明显，2种细菌的生长规律相似，在0~4 h细菌数维持不变，而在4~6 h大量生长，在6 h以后细菌数则基本保持不变，可以认为在18 h细菌均处于稳定期。

　　2.2 核磁共振图谱的测定

　　图2和图3分别为血链球菌和远缘链球菌生长18 h的细胞外代谢产物核磁共振图谱。2种细菌代谢物图谱轮廓比较相似，均在化学位移值为8.3×10-6、4.0×10-6、1.9×10-6、1.2×10-6和0.8×10-6处有很强的峰出现。但不同的是，血链球菌在以上各个化学位移值的峰明显都比远缘链球菌在相同位置的峰更高。

　　2.3 主成分法分析

　　PCA的目的是发现数据集中的聚类关系。本实验将积分数据导入软件，得到5组主成分。以主成分矢量为坐标轴作二维得分图，可以反映类别间的差异。将主成分两两进行比较，发现PC1关于PC3的得分图(图4)和PC3关于PC5的得分图(图5)可以清楚地区分2种细菌。图中的椭圆形区域代表95%的置信区间。

　　从图4可以看出，黑色点代表的血链球菌和红色点代表的远缘链球菌有各自的聚类关系，其中血链球菌点较为密集，有较好的团聚性，而远缘链球菌的点则相对分散，但也可以与血链球菌进行有效区分。图5为PC3和PC5进行的二维比较图，虽然远缘链球菌相对血链球菌仍然较为离散，但是2种细菌组间并无明显的交叉与重叠，从图上依然可以清楚地区分2种细菌。

　　3 讨论

　　作为一门研究生物体内源性代谢物整体及其变化规律的科学，代谢组学实际上是以物理学基本原理为基础的分析化学、以数学计算与建模为基础的化学计量学和以生物化学为基础的生命科学等学科交叉的学科[4]。它利用分析化学的各种谱学技术，包括核磁共振波谱、质谱、色谱、红外和拉曼光谱、紫外—可见光谱等及其偶合联仪方法对生物系统(具体的研究对象为生物体液包括尿液[5]、血清[6]以及组织提取液)由于病理生理刺激或基因改变所引起的代谢变化进行系统测量和分析，以获得其中丰富的代谢信息。这样得到的代谢组学数据其实是相当庞大且多维的信息，无法进行细化处理。为了充分抽提所获得数据中的潜在信息，需要用到一系列的化学计量学方法和多元统计学理论对采集到的多维海量原始信息进行压缩降维和归类分析，从中有效挖掘出有用信息，以解读代谢组学数据中蕴藏的生物学意义。

　　代谢组学的目标是对限定条件下的特定生物样品中所有的代谢组分进行定性和定量分析。因此，要求样品的预处理和检测技术必须满足对样品中所有代谢组分具有高灵敏度、高选择性、高通量的要求，并且基体干扰要小，处理数据所采用的方法也必须适应信息海量和多维的特点。但直到现在，代谢组学的这个最终目标还是不可完成的任务，因为还没有发展出一种真正的代谢物组学技术可以涵盖所有的代谢物而不管分子大小和性质。正因如此，目前代谢组学关注的主要是相对分子质量在1 000以下的内源性小分子。

　　本实验关注的也是2种口腔细菌胞外的小分子代谢产物，在得到细菌培养液的核磁共振代谢图谱后，首先要对核磁图谱在一定区间内进行积分和权重处理，将样本的核磁图形转换为数据，以数据形式代表原波谱图。然后将处理后的数据输入SIM-CA-P软件进行主成分分析[7]，进一步简化数据，通过图形转换生成的199组数据最终被简化为5组主成分，最后将这些主成分的得分图进行对比分析。由于2种细菌同为链球菌，并且在相同培养液中生长，代谢产物大体相同，因此2种细菌的代谢物图谱轮廓比较相似。虽然如此，在主成分1关于主成分3以及主成分3对主成分5的得分图中，血链球菌和远缘链球菌细菌组仍然呈现出组内成团、组间离散的特点，可以进行有效区分。NMR作为当前代谢组学研究中的主要技术，它的优势在于能够对样品实现非破坏性、非选择性的分析，但由于其对每个分子的化学和物理环境敏感，因此对样品制备的要求很高，在2张得分图中出现的较为离散甚至在椭圆形的95%置信区间以外的样本应该就是制样不好所致。

　　代谢组学经过近几年的高速发展，其在微生物领域的应用已经扩展到微生物分类、突变体筛选、功能基因研究、发酵工艺监控与优化以及环境微生物研究等多个方面[8]。代谢组学方法在微生物鉴定方面的优势也逐渐展现出来，与现有的细菌鉴定方法相比，基于核磁共振的代谢组学方法具有样品处理简单、检测快速(上样检测只需5 min)、成本低、

　　对样品无破坏性等优点。本实验将代谢组学方法用于与龋病有关的2种口腔链球菌——血链球菌和远缘链球菌胞外代谢产物的研究，为系列研究，即将代谢组学方法用于口腔致病菌研究[9-10]的一部分，实验结果也表明基于NMR的代谢组学及一系列化学计量学和多元统计学方法可以区分不同的细菌，与已有研究结果一致。在以后的研究中，可以考虑利用色谱等方法和手段分析引起核磁共振图谱差异的化合物的种类，并确定与细菌代谢紧密相关的生物标记物。当建立起了多种细菌的标准代谢物数据库，就可以利用成熟的技术平台实现细菌的快速鉴定与分类，这也是对已有细菌鉴定方法的丰富与发展。

　　作为继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后在学术界兴起的又一门新的系统生物学分支，代谢组学已经在生命科学和医药技术领域展现出广阔的发展空间，但同时也面临巨大挑战，如何发展与优化现有的实验测量方法与技术，如何实现代谢组学数据与其他组学数据的整合，以及代谢组学方法、信息和数据库标准的制定，都是未来代谢组学研究所要解决的重要问题。相信随着研究的深入，代谢组学能够帮助人们更好地解读生命现象，系统认识复杂的生物网络，这门新兴学科也必将在口腔微生物生态学的研究中得到更加广泛的应用。

　　【参考文献】

　　[1] 郭宾, 戴仁科. 代谢组学及其研究策略和分析方法进展[J]. 中国卫生检验杂志, 2007, 17(3)：554-563.GUO Bin, DAI Ren-ke. Current trends in analytical methodolo- gies and experimental strategies for metabonomics[J]. Chin J HealthLaboratory Technology, 2007, 17(3)：554-563.

　　[2] Bundy JG, Willey TL, Castell RS, et al. Discrimination of pa-thogenic clinical isolates and laboratory strains of Bacillus cereusby NMR-based metabolomic profiling[J]. FEMS Microbiol Lett,2005, 242(1)：127-136.

　　[3] Brecker L, Weber H, Griengl H， et al. In situ proton-NMR analy-ses of Escherichia coli HB101 fermentations in 1H2O and in D2O[J]. Microbiology(UK), 1999, 145(12)：3389-3397.

　　[4] 唐惠儒, 王玉兰. 代谢组研究[J]. 生命科学, 2007, 19(3)：272-280.TANG Hui-ru, WANG Yu-lan. Metabonomics[J]. Chinese Bul-letin Life Sciences, 2007, 19(3)：272-280.

　　[5] Lindon JC, Nicholson JK, Holmes E, et al. Metabonomics：Metabolic processes studied by NMR spectroscopy of biofluids[J].Concepts Magn Reson, 2000, 12(5)：289-320.

　　[6] Nicholson JK, Foxall PJ, Spraul M, et al. 750 MHz 1H and1H-13C NMR spectroscopy of human blood plasma[J]. Anal Chem,1995, 67(5)：793-811.

　　[7] Bourne R, Himmelreich U, Sharma A, et al. Identification ofEnterococcus, Streptococcus, and Staphylococcus by multivariateanalysis of proton magnetic resonance spectroscopic data fromplate culture[J]. J Clin Microbiol, 2001, 39(8)：2916-2923.

　　[8] 周宏伟, 谭凤仪, 钟音, 等. 代谢组学及其在微生物领域的研究进展[J]. 分析化学, 2007, 35(2)：309-314.ZHOU Hong-wei, TAN Feng-yi, ZHONG Yin, et al. Recentdevelopment of metabolomics and its applications in microbiology[J]. Chin J Analytical Chemistry, 2007, 35(2)：309-314.

　　[9] 李淼, 肖丽英, 李继遥, 等. 常见致龋菌代谢组学鉴定的初步研究[J]. 华西口腔医学杂志, 2007, 25(4)：342-344.LI Miao, XIAO Li-ying, LI Ji-yao, et al. Initial study on dis-crimination of microorganisms with the metabonomics technique[J]. West China J Stomatol, 2007, 25(4)：342-344.

　　[10] 熊萍, 肖丽英, 李继遥, 等. 变异链球菌、 血链球菌及嗜酸乳杆菌代谢组学鉴定的初步研究[J]. 华西口腔医学杂志, 2008, 26(5)：537-540.