口腔癌中HSP-70表达和临床的关系

　　作者：郑顺友 朱翌 丁熙 朱形好 作者单位：325000 温州医学院附属第一医院口腔科

　　【摘要】 目的 探讨HSP-70的表达和口腔肿瘤临床的关系。 方法 本研究采用免疫组化和酶联免疫吸附法检测HSP-70在口腔肿瘤细胞和血清中的表达，观察其临床相关性。 结果 (1)48例口腔肿瘤组织中，高表达16例(34%)，低表达32例(66%)，其中38例HSP-70表达阳性，阳性率为78%;(2)HSP-70组织高表达在1、2期肿瘤中为16%，3、4期为45%，二者差异有显著性(P<0.05)。HSP的表达在性别、年龄、淋巴结转移之间差异无显著性。HSP-70血清表达与各项临床病理特征之间差异均无显著性(P>0.05 )。 结论 检测HSP-70 可作为判断口腔肿瘤恶性程度的一个指标。

　　【关键词】 HSP-70 口腔肿瘤 免疫组化

　　基金项目:温州市科技计划项目资助 Y2005A120 浙江省教委课题项目资助 20030785

　　【Abstract】 Objective To explore HSP-70’s expression and its correlation with clinical pathologic findings in oral carcinoma. Methods Immunohistochemistry and enzyme linked immunosorbent assay were applied to measure the expression of HSP-70 in oral carcinoma cells and serum ,and their correlation was evaluated . Results (1)Among the 48 cases of oral carcinoma , 16 cases(34%)had high expression ，32 cases(66%)had low expression, among them ,HSP-10 was positive in 38 cases ,with the positive rate of 78%; 2. HSP-70 was highly expressed in tissues of 16% cases of 1,2 stage , which is significantly different from its expression in tissues of of 45% cases of stage 3,4(P<0.05 ).There was no significant difference in HSP-70 's expression among cases of difference sex 、age and lympher node metastasis .There was no significant difference in HSP-70 's expression among tissues with different clinical pathological characters (P>0.05). Conclusions Level of HSP-70's expression can be an index for judging the malignancy of oral carcinoma.

　　【Key words】 HSP-70 Oral carcinoma Immunohistochemistry

　　热休克蛋白(heat shock proteins ,HSPs) 是生物细胞在受到各种细胞损伤因素刺激时产生的一类高度保守的蛋白质,按分子量的大小和同源程度分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60 和小分子HSPs等5 个家族,不同的HSPs家族不但分子大小不同,而且其生物学功能亦有差异。HSP-70 家族由位于细胞内不同部位数量极多的成员组成,是细胞内含量最多的HSPs ,它在多肽的解离、转运和在蛋白复合物的装配和分解过程中起着重要作用。研究发现,在某些恶性肿瘤中,HSP-70基因的激活与肿瘤发展程度和患者的预后关系密切。本研究采用免疫组化和酶联免疫吸附法检测HSP-70在口腔肿瘤细胞和血清中的表达，观察其临床相关性，探讨其与口腔癌的分级和分期的关系,为临床进一步判断预后提供依据。

　　1 资料与方法

　　1.1 一般资料

　　标本取自温州医学院附属第一医院口腔科2004年8月至2006年7月活检标本和手术切除的肿瘤患者。并经病理证实为口腔鳞状细胞癌48例，男31例，女17例;年龄28～8l岁。舌癌24例，唇癌9例，牙龈癌7例，口底癌4例，颊癌4例。其中淋巴结转移阳性者2l例。并根据1997年WHO鳞状细胞癌分级标准分级：高分化32例，中分化l3例，低分化3例。健康人20例作为血清对照组。按UICC 分期，1期7 例，2期21 例，3 期13例，4期7例。

　　1.2 主要试剂

　　免疫组化用HSP-70单抗及试剂盒，相对应已知阳性片购自福建，酶联反应用人胎盘HSP-70抗原，鼠抗人HSP-70 单克隆抗体试剂购自晶美××公司。其他试剂由温州医学院附属第一医院病理科提供。

　　1.3 免疫组化

　　石蜡块连续切片，厚约5μm，每一标本分别行HE染色，HSP-70常规脱蜡后PBS洗，加3%双氧水阻断内源酶10min， 蒸馏水洗;枸椽酸缓冲液浸泡下微波处理(90℃ 5min×2次)，PBS洗;5%正常羊血清封闭非特异染色37℃ 30min，不洗，加一抗37℃ 1h，PBS洗;加生物素标记二抗37℃ 30min，PBS洗;加SA-HAP 复合物37℃ 30min,PBS洗;DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。48例肿瘤标本，一批完成。已知阳性片作阳性对照，PBS 代替-抗作阴性对照。结果判断： HSP-70着色部位在细胞质或细胞核。光镜下存在棕黄色或棕褐色颗粒为阳性，按切片中阳性细胞占全部细胞数的百分数，表达强度分为4级：(-)阳性细胞数<10%;(+)阳性细胞数10 %～30 % ;()阳性细胞数31%～50%， ()阳性细胞数>50%,其中(-)、( + )为低表达组，() 、()为高表达组。

　　1.4 酶联反应

　　用双抗体夹心定量ELISA 检测法，血清用0.01 mol PBST 稀释，每孔加样100μl , 37 ℃ 孵育60 min，洗板6 次。各孔加入抗HSP-HRP酶结合物100μl , 37 ℃ 孵育60 min ，洗板6 次。各孔加入TMB底物液1 00μl, 37 ℃ 孵化育15 min。2mol H2SO4 终止反应。结果判断：30min 内以微孔板读数器在波长450 nm 测定OD 值。

　　1.5 统计学处理

　　用SPSS软件，分别采用t检验和四格表卡方检验。

　　2 结果

　　2.1 HSP-70在口腔肿瘤组织中的表达

　　48例口腔肿瘤组织中，，高表达16例，低表达32例;38例HSP-70表达阳性，其中弱阳性22例，中度阳性11例，强阳性5例，着色部位主要以胞核为主。

　　2.2 HSP-70在口腔肿瘤血清中的表达

　　见表1。表1 口腔肿瘤患者血清HSP-70表达(略)

　　2.3 HSP-70表达与口腔肿瘤临床病理的关系

　　HSP-70组织表达中，在1、2期肿瘤中为16%，3、4期为45%，二者差异有显著性(P<0.05)。HSP-70的表达在性别、年龄、淋巴结转移之间差异无显著性。HSP-70血清表达与各项临床病理关系见表2。表2 口腔肿瘤患者HSP-70表达和临床病理的关系(略)

　　3 讨论

　　热休克蛋白70 是在热诱导下合成的具有高度保守性蛋白。在细胞周期调节、DNA 损伤的控制、基因产物的代谢和癌变方面起着重要作用,具有分子伴侣、细胞保护功能等。热休克蛋白70 基因被激活后,表达增强(即HSP-70 增多) ,有资料显示HSP-70 与细胞转化的调节过程和肿瘤排斥机制有关,是癌细胞增生的标志[1]。腺病毒E1A 基因产物能诱导细胞HSP-70 表达上升。在用ras 或myc 转化培养的细胞或用ras/ p53共转化培养的细胞, HSP-70 基因表达均增强。经HSP-70 反义脱氧寡核苷酸处理的肿瘤细胞不仅表现出生长抑制,而且诱导该细胞凋亡(apoptosis)。由此,可知HSP-70 作为一种重要的基因参与了恶性肿瘤细胞增殖的转录调控过程。同时HSP-70 的高表达增强了肿瘤细胞抗凋亡的能力,使细胞的生长抑制效应和死亡减弱,进而向周边组织浸润和转移。有研究表明,这是因为在肿瘤的发生、发展的复杂过程中,热休克蛋白70 在肿瘤细胞中异常表达,能与癌基因、抑癌基因产物结合,形成异源蛋白复合体,介导癌蛋白构象成熟及转运,从而参与细胞成熟及转运过程。本结果表明在口腔肿瘤中HSP-70阳性率高达78%，证实了HSP-70在口腔肿瘤癌变中的重要作用。研究发现,HSPs表达有助于评估肿瘤的病理分级、淋巴转移和预后。如研究发现,胃癌，宫颈癌，膀胱癌，喉癌等组织中HSP-70 的表达与细胞的增殖、分化及病理分级有关[2～4]。本组也发现HSP-70组织表达在1、2期肿瘤中为16%，3、4期为45%，二者差异有显著性(P<0.05 ) 。说明HSP-70 表达与口腔肿瘤的恶性程度和浸润深度有关，因此,检测HSP-70 可作为判断口腔肿瘤恶性程度的一个指标。

　　同时, 细胞外也可有少量可溶性HSP-70。 因此, 通过定量检测血清中的HSP-70, 可间接反映疾病与热休克蛋白之间相互作用的关系[5]。但本试验没有发现HSP血清表达与各项临床病理特征之间的关系。其HSP-70具体分型和临床TNM细致分级的关系还有待下一步深入研究。

　　【参考文献】

　　1 崔彦, 董家鸿. HSP70生物学特性及在原发性肝癌中的表达意义. 中华肝胆外科杂志, 2005,11(08):571～573.

　　2 刘瑞芳,赵安芳,陈兰英,等. HSP70基因在人胃癌、宫颈癌中高表达和癌变关系的研究. 平顶山工学院学报, 2004,13(03):62～63.

　　3 张江兰,陈秀玲,薄爱华,等. HSP27和HSP70在膀胱癌中的表达和意义. 张家口医学院学报, 2004,21(01):22～24.

　　4 杨淑芝,陈海燕,韩德民,等. 喉癌组织HSP70的检测. 中国耳鼻咽喉颅底外科杂志, 2003,9(01):51～52.

　　5 门可,王霞,周宏超,等. 血清中HSP70定量检测方法的建立. 第四军医大学学报, 2001,22(20):1835～1837.