两种获取牙龈卟啉单胞菌基因组DNA方法比较
发表时间:2010-10-13 浏览次数:434次
作者:陈晓涛,钟良军,杨柯,钱雅静,李泽慧 作者单位:新疆维吾尔自治区人民医院口腔科, 新疆乌鲁木齐830001
【摘要】 目的: 筛选方便、快捷、有效地获取细菌基因组DNA的方法。方法: 采用UNIQ10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒法和Chelex100法获取患者龈下菌斑DNA,比较作为PCR扩增模板检测牙龈卟啉单胞菌感染位点的检出率差异,并对2种方法进行比较。结果: 试剂盒法与Chelex100法对牙龈卟啉单胞菌的感染位点检出率差异无统计学意义,但Chelex100法提取DNA更简单、快速。结论:Chelex100法抽提细菌基因组DNA适用于对大样本牙周炎患者作细菌学检测分析。
【关键词】 DNA; 牙龈卟啉单胞菌; 试剂盒法; Chelex100法
The comparison of two ways for extraction of DNA from dental plaque
CHEN Xiaotao, ZHONG Liangjun, YANG Ke, et al
(Department of Stomatology, The People′s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region, Urumqi 830001, China)
Abstract: Objective: The study was performed to try an alternative method as DNA source for PCR detection. Methods: DNA of subgingival plaque was extracted by two differedt kinds of methods,which were UNIQ10 Bateria Kit and Chelex100 assay . The obtained DNA were used as template to detect Porphyromonas gingivalis. Result: There was no statistically significance between two methods. Conclusion: Chelex100 assay was simple and conventional in extraction of bacteria DNA.
Key words: DNA; porphyromonas gingivalis; kit assay ; Chelex100
牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis, 简称P.g)是公认的慢性牙周炎优势致病菌之一,与牙周炎的发生、治疗后复发或病情加重密切相关。由于该菌属难培养的厌氧菌,分离鉴定程序繁琐,不利于进一步的研究。应用聚合酶链式反应(PCR反应)检测P.g具有敏感、特异和快速等优点。提取足够量的DNA并使DNA的链完整,蛋白含量尽可能低是PCR反应成功的关键。目前,细菌DNA提取方法众多,但由于提取机理和步骤的差别,获得DNA的量及纯度各不相同。本实验采用UNIQ10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒法和Chelex100法获取慢性牙周炎患者的细菌基因组DNA,通过PCR技术扩增目的片断,比较牙龈卟啉单胞菌在患病相同感染位点的检出率,旨在筛选一种操作简单、快捷、价廉的方法,以有效获取细菌基因组DNA。
1材料和方法
1.1样本收集
选取2005年4月~2005年12月在新疆医科大学第一附属医院、新疆维吾尔自治区人民医院和和田县人民医院口腔科就诊的52例慢性牙周炎患者,在2颗患牙的牙周袋最深部位作为采样的位点。无菌棉球隔湿、干燥后,用无菌刮治器沿根面收集位于患牙牙周袋底的龈下菌斑,置入盛有0.5 ml厌氧转运液的EP管中封存,于-20℃低温保存。
1.2试剂和设备
1.2.1试剂UNIQ10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒 (上海);Chelex100(美国); 琼脂糖(英国);无菌去离子纯水(自制);蛋白酶K;10×PCR缓冲液;dNTP、TaqDNA聚合酶;Puc19/Marker;细菌特异性引物(均由上海生工生物工程公司提供)。
1.2.2主要设备恒温水浴箱(SHH.W21型,上海);高速台式离心机(TGL13,上海);PCR扩增仪(美国 BIORAD公司);电泳仪(DYYⅢ2,北京六一);水平电泳槽(北京六一);凝胶成像仪(BioSensSC720 ,上海山富科学仪器有限公司)。
1.3方法
1.3.1DNA模板制备(1)试剂盒法抽提DNA: 取菌斑样本,室温解冻, 根据说明书进行分离。首先震荡混匀10~15 s,离心(4℃,15 000 r/min, 5 min)收集细菌沉淀。加入200 μl含溶菌酶的TE(400 μg/ml),酶解4 min。加入400 μl Digestion Buffer 混合所有菌细胞悬液,继续加入 proteinase K 3 μl,在55℃保温5 min。加入无水乙醇260 μl,混匀后转移到套放于2 ml的收集管内的UNIQ10柱中,室温下离心(8 000 r/min, 1 min),弃废液。加入500 μl Wash Solution轻轻混匀,离心(4℃,10 000 r/min, 30 s),反复2次。离心空柱后更换新的EP管,最后加Elution Buffer 40 μl,室温下离心,室温放置2 min,离心管中的液体即为基因组DNA。 (2)Chelex100法抽提DNA: 取菌斑室温下解冻,震荡混匀10~15 s,离心(4℃,15 000 r/min, 5 min)收集沉淀。加入5% Chelex100液20 μl,在100℃水浴10 min,,立即冰浴1 min,室温下离心(12 000 r/min,10 min),取上清液备用。-20℃保存。
1.3.2目的基因扩增PCR反应条件: 总反应体积20 μl,引物各0.8 μl (10 μmol/L), DNTP 0.4 μl(10 μmol/L), 10×PCR缓冲液2 μl, MgCl2 1.2 μl (25 mmol/L ), TaqDNA聚合酶0.5 U, 模板DNA 2 μl ,用无菌去离子水补足总体积至20 μl 。循环参数:95℃预变性反应2 min, 95℃变性30 s,60℃复性1 min,72℃延伸1 min, 36个循环,最后72℃延伸2 min, 4℃保存。4 μl PCR产物点样,经1.5%琼脂糖凝胶电泳 (100 V, 45 min),凝胶成像仪读取结果,证实获得的扩增产物为404 bp的目的基因片段。以P.g标准菌株ATCC33277作为阳性对照(四川大学口腔生物医学工程教育部重点实验室提供),等体积三蒸水作为空白对照。
1.3.3PCR质量控制措施所有实验标本的测定均在盲法下进行,并随机抽取10%的样本做重复性实验,检测PCR结果的可靠性。
1.4统计学处理应用SPSS 11.0软件包进行统计学分析,采用Fisher′s精确概率法进行χ2检验,检验水准α=0.05。
2结果
2.12种方法的操作比较试剂盒法提取龈下菌斑DNA共需耗时50 min, 分九步完成,所需检测成本为8元/份。Chelex100法抽提DNA的操作仅需要三步,15 min完成全部过程, 成本为0.5 元/份。
2.22种方法对牙龈卟啉单胞菌感染位点的阳性检出率比较采用P.g的16SrRNA PCR鉴定有78个位点感染牙龈卟啉单胞菌,其中试剂盒法检出49个(62.8%),Chelex100法检出46个(58.7%),经检验,2种方法检出率差异无统计学意义(χ2=0.242, P>0.05 )。
2.3PCR结果典型电泳结果经1.5%琼脂糖凝胶电泳 (100 V, 45 min,),凝胶成像仪读取结果,证实试剂盒法和Chelex100法提取到细菌基因组DNA,均获得的扩增产物为404 bp的目的基因片段,见图1。
3讨论
牙龈卟啉单胞菌是慢性牙周炎病变区或活动部位最重要的优势致病菌之一。传统的培养法检测龈下菌斑中的牙龈卟啉单胞菌周期长,易污染,并且阳性率低。Wahlfors等[1]报道,聚合酶链反应(PCR)可检测到5~50个P.g细胞,其阳性率远高于培养法,且具有敏感、特异和快速等优点。而基因组DNA的分离和纯化是分子生物学PCR技术的基础工作。柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒的基本原理是柱的底部有一层惰性大分子基质材料,当样品经细胞裂解处理后, 加入离心柱内,通过高速离心,DNA能被高效选择性地吸附在固态膜上,而绝大多数杂质(蛋白质、糖类、脂类和盐等)均可被膜离心掉,再经两次洗脱将残留在固态膜上的微量杂质(主要是二价阳离子和一些杂蛋白等)除去,最后缓冲液洗脱获得高纯度的DNA。但其操作繁琐、耗时,操作过程中有时会出现蛋白酶消化不完全所致柱子阻塞现象。 Chelex100是一种螯合型的离子交换树脂,由苯乙烯和苯乙二烯组成的聚合物,包含成对的亚氨二乙酸离子。Walsh等[2]最初用Chelex100作为金属离子螯合剂来提取人类DNA。Stein等[3]研究发现,含有5% Chelex100悬液在碱性环境(pH 10~11)和100℃煮沸时可使细胞膜破裂,释放出DNA,并能与Mg2+、Ca2+等核酸反应必需的二价金属阳离子螯合,从而保护DNA,防止基因组DNA在抽提过程中降解成小片段, 有利于靶DNA片段的扩增,并减少杂带,提高了PCR扩增的效率[4]。Lamballerie等[5]从培养和临床标本中快速提取细菌及病毒DNA用于PCR反应,并对150例临床标本提取DNA进行PCR检测分歧杆菌,结果表明,用此方法比碱裂解后传统的蛋白酶K消化、酚/氯仿抽提法可获得更多的阳性样本。
本研究采用试剂盒法和Chelex100法从慢性牙周炎龈下菌斑中提取细菌基因组DNA,结果提示,2种方法对牙龈卟啉单胞菌的感染位点检出率差异无统计学意义。但Chelex100法有着不可代替的优点: (1)步骤简单,大大减少DNA提取的工作量,整个过程仅15 min即可完成。(2)由于Chelex100提取DNA整个操作在1个Ep管中进行,可减少多次抽提换管的污染机率。(3)价廉,成本低。因此,对临床大样本牙周炎患者做微生物学研究时,Chelex100法是一种有效、简便的细菌基因组DNA提取方法。
【参考文献】
[1]Wahlfors J, Meurman JH, Vaisanen P, et al. Simultaneous detection of Actionbacillus actinomycetemcomitans and Porphyromonas gingivalis by PCR method[J]. Dent Res ,1995,74(11):1796 1801.
[2]Walsh PS, Metzger DA, Higuchi R. Chelex100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR based typing from forensic material[J]. Biotechniques, 1991,10(4):506513.
[3]Stein A, Rooult D. As imple method for amplification of DNA from paraffin embedded tissues [J]. Nucleic Acids Research,1992,20:5237.
[4]吴梅筠.法医物证学[M].北京:人民卫生出版社,1998.202.
[5]Lamballerie XD, Zandotti CA. One step microbial DNA extraction method using ‘Chelex100’ suitable for gene amplication[J]. Res Microbiol,1992,143:758790.