乳铁蛋白对口腔鳞癌细胞增殖的影响

　　作者：王雷 高文信 柳淑杰 作者单位：吉林大学口腔医学院，吉林 长春 130041

　　【摘要】 目的 探讨乳铁蛋白(LF)对体外培养的舌癌细胞Tca8113增殖的影响。方法 MTT法评定LF对中国仓鼠CHO、人胚肾293T及舌癌细胞Tca8113细胞系的生长抑制作用。结果 LF对Tca8113细胞具有直接的细胞毒作用且呈剂量依赖性，但对正常细胞系增殖无抑制作用。结论 LF作为新的口腔肿瘤的化学预防剂，可抑制舌癌细胞Tca8113增殖。

　　【关键词】 乳铁蛋白;口腔鳞癌细胞;增殖

　　基金项目：国家“十五”科技攻关资助项目(2004BA720A28);吉林省科技发展计划项目(No.200705346);长春市科技计划项目(长科技合No.2004063)

　　Effect of lactoferrin on proliferation of human oral squamous cell carcinoma cell line

　　WANG Lei，GAO Wen-Xin，LIU Shu-Jie.

　　Stomatological Hospital of Jilin University，Changchun 130041，Jilin，China

　　【Abstract】 Objective To explore the effect of lactoferrin on proliferation of the cultured Tca8113 cells in vitro.Methods MTT was used to evaluate the growth inhibiting effect of lactoferrin on Tca8113，CHO and HEK293T cells.Results Lactoferrin significantly inhibited the proliferation of Tca8113 cells in a dose dependent manner，but had no effect on the normal cells.Conclusions Lactoferrin as an oral cavity cancer chemopreventive agent could significantly inhibit the growth of Tca8113 cells.

　　【Key words】 Lactoferrin;Oral squamous cell carcinoma cell line;Proliferation

　　口腔癌是世界上第6种最常见的癌症，随增龄而增加〔1〕。目前提倡用天然复合物干预肿瘤的生长。乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)亦称乳转铁蛋白(Lactotransferrin)，是主要存在于哺乳动物乳清中的球蛋白，存在于多种组织中，在各种体液或分泌物中以乳汁特别是初乳中LF含量最高〔2〕，牛奶中含有较高浓度LF，在哺乳动物的很多外分泌物中也存在较低浓度LF，如，眼泪、唾液和精液等〔3〕。近来研究发现，LF具有多种生物学活性，其生物活性与免疫系统的活性及免疫调节有关，其抗炎、抗菌活性是由免疫系统的活性介导的〔4，5〕。很少有实验来评估人LF用于肿瘤的治疗，本实验欲证实LF对口腔鳞状癌细胞具有体外抑制作用，对正常细胞体外没有抑制作用，为以后进一步的动物实验和临床实验提供依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料 Tca8113 口腔舌癌细胞系、CHO 中国昌鼠细胞系、293T人胚肾细胞系均购于上海细胞研究所。重组人LF(溶于PBS中，储存浓度5 mg/ml，-20℃储存备用)和噻唑蓝(MTT)均购自SIGMA公司。DMEM培养基购于GIBCO公司。

　　1.2 细胞培养 各细胞系细胞分别用10%胎牛血清的DMEM培养基，5%CO2，37℃培养、传代。

　　1.3 噻唑蓝比色分析法(MTT)法 实验设空白对照组和LF干预组。Tca8113、CHO、293T细胞分别接种于96孔细胞培养板，细胞数5×104/孔，用不同浓度LF(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 μg/300 μl)分别处理24 h，每组细胞设3个平行孔，加入MTT，继续培养4 h，A570 nm测定吸光度，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值。

　　1.4 细胞形态变化 正常细胞，鳞癌细胞经各浓度LF处理24 h后PBS漂洗，倾去上层悬浮死细胞后加入新鲜培养基，作为LF干预组。另备一瓶细胞未用任何药物处理，将其作为对照组细胞。将培养瓶置于CK倒置显微镜下，观察LF干预前后鳞癌细胞的不同形态。

　　1.5 统计学处理 数据用x±s表示，采用t检验。

　　2 结果

　　2.1 重组人LF对Tca8113、CHO、293T细胞增殖能力的影响 MTT法实验显示，除0.5 μg/300 μl外，其他浓度的LF均抑制Tca8113细胞增殖(P<0.05)，呈剂量依赖性，但各浓度LF对CHO、293T细胞增殖均无抑制作用(表1)。

　　表1 LF对各细胞系细胞增殖的影响(略)

　　与对照组比较：1)P<0.05

　　2.2 细胞形态学观察 镜下可见，空白对照组鳞癌细胞胞质丰富呈多角形。癌细胞密集成片生长，嵌合如铺路石。LF组细胞正常形态发生明显的改变，细胞从正常的增殖旺盛的贴壁生长，随LF浓度增加，细胞的黏附力降低，失去贴壁性，伪足消失，细胞变圆，生长缓慢，分裂相减少或消失，胞质粗糙，内有颗粒堆积，并可见细胞明显回缩，形态完整性遭到破坏(图1)。

　　图1 两组Tca8113细胞株的细胞形态变化(×100)(略)

　　3 讨论

　　LF是一种糖蛋白，存在于母乳中，先前已经发现具有抗菌的特性，近来证明LF可以通过免疫调节来抑制恶性肿瘤的生长。一些学者观察了牛LF的抗癌作用，在癌始发后阶段经口腔给药，牛LF可以明显抑制鼠结肠、食道、肺以及膀胱癌的发生〔6〕。人和牛的乳铁传递蛋白之间的顺序同源性高达69%。不同物种，甚至同一物种不同来源的LF分子之间，其理化性质可能有所差异。例如，人乳和牛乳中的LF通过SDS-PAGE均能分离出表观分子质量不同的两个组分〔7〕。此外，LF具有机体特异性，牛的LF不一定能被人体吸收，人体中的LF吸收与利用与机体内的特殊受体有关。

　　LF可以明显抑制体内肿瘤的生长。Bezault等〔8〕研究发现，LF可以抑制鼠实体瘤的生长及转移。肿瘤内注射LF可以明显缩小肿瘤的体积，肿瘤体积的减小和LF干预的天数有关，肿瘤体积随着干预天数的增加逐渐减少。

　　体外研究中，LF是否具有调节细胞生长的功能，不同学者持有不同的观点。Mignogna〔9〕等研究发现，牛LF对人舌鳞状细胞癌细胞株CYA-27和正常人成纤维细胞株HGF没有细胞毒作用，不会抑制体外培养的正常细胞及鳞癌细胞的生长。Wolf〔10〕等研究也认为LF在体外没有直接的细胞毒作用。但是近几年的研究发现，人LF可以抑制头颈部鳞状细胞癌，是通过直接的细胞毒作用以及系统性的免疫调节作用来实现的〔11〕。Xiao〔12〕等的研究也证明LF体外抑制3种不同的头颈部细胞的增殖。Mckeown〔13〕研究综合了以上两种观点，认为LF对口腔鳞癌的作用是变化的，12.5 μg/ml LF作用鳞癌细胞48 h可以引起细胞增殖，但72 h时引起细胞凋亡。大剂量(250，100，50 μg/ml)LF 72 h均可诱导细胞凋亡。迄今，尚无研究发现LF刺激体外口腔鳞状细胞生长。本实验结果显示重组人LF对正常细胞的生长无抑制作用，但对鳞癌细胞的生长具有抑制作用。重组人LF对Tca8113细胞的抑制作用呈剂量依赖性。

　　Varadhachary〔14〕等通过12次不同的实验给211人口服LF，包括110名健康志愿者或无症状患者，57名化疗患者，44名未作化疗的肿瘤患者。LF有很好的相容性并且无药物相关性死亡，也没有其他严重有害事件报道，表明口服LF可以有效地延缓肿瘤发展，是一种安全有效的新的抗癌制剂。

　　【参考文献】

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　　8 Bezault J，Bhimani R，Wiprovnick J,et al.Human lactoferrin inhibits growth of solid tumors and development of experimental metastases in mice〔J〕.Cancer Res，1994;54:2310-2.

　　9 Mignogna MD，Fedele S，Lo Russo L.The World Cancer Report and the burden of oral cancer〔J〕.Eur J Cancer Prev，2004;13:139-42.

　　10 Wolf JS，Li D，Taylor RJ,et al.Lactoferrin inhibits growth of malignant tumors of the head and neck〔J〕.ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec，2003;65(5):245-9.

　　11 Wolf JS，Li G，Varadhachary A,et al.Oral lactoferrin results in T cell-dependent tumor inhibition of head and neck squamous cell carcinoma in vivo〔J〕.Clin Cancer Res，2007;13(5):1601-10.

　　12 Xiao Y，Monitto CL，Minhas KM,et al.Lactoferrin down-regulates G1 cyclin dependent kinases during growth arrest of head and neck cancer cells〔J〕.Clin Cancer Res，2004;10:8683-6.

　　13 Mckeown S，Lundy FT，Nelson J,et al.The cytotoxic effects of human neutrophil peptide-1 (HNP1) and lactoferrin on oral squamous cell carcinoma (OSCC) in vitro〔J〕.Oral Oncol，2006;42：685-90.

　　14 Varadhachary A，Wolf JS，Petrak K，et al.Oral lactoferrin inhibits growth of established tumors and potentiates conventional chemotherapy〔J〕.Int J Cancer，2004;111(3):398-403.