雌激素对去卵巢大鼠拔牙创骨愈合影响的电镜观察

　　作者：朱晓姝 李晓红 苏兴宇 赵献银 郭三萍 作者单位：北京大学医院口腔科，北京 100871

　　【摘要】 目的 研究雌激素对去卵巢大鼠拔牙创骨愈合的影响。方法 取55只雌性SD大鼠随机分为3组：模型组及雌激素组大鼠行去势手术,制备去卵巢大鼠骨质疏松模型，假手术组行假手术。假手术组和模型组仅予生理盐水，雌激素组予雌二醇至实验结束。所有大鼠手术后8 w拔除左侧上颌第一磨牙，拔牙术后第7、30、60天分3批处死大鼠，上颌拔牙创口处行扫描电镜观察。结果 拔牙术后第7天扫描电镜观察3组大鼠拔牙创内新生骨骨表面相差不大，拔牙术后第30、60天时模型组拔牙创面新生骨较其他两组明显纤细、量少。模型组拔牙创愈合过程中，剩余牙槽嵴整个长度有一层与其他两组表面结构不同的组织。结论 骨质疏松可能导致拔牙创愈合过程中骨形成方式不同，延长成年大鼠拔牙创愈合时间，而雌激素治疗能明显减少骨质疏松对拔牙创骨愈合的影响。

　　【关键词】 骨质疏松;拔牙创;雌激素

　　基金项目：陕西省自然科学基金资助课题(2000SM52)

　　The SEM observation of the effect of estrogen on bone wound healing of extracted teeth in osteoporotic rats

　　ZHU Xiao-Shu, LI Xiao-Hong, SU Xing-Yu, et al.

　　Peking University Hospital, Beijing 100871, China

　　【Abstract】 Objective To investigate the effect of estrogen on bone wound healing progress of extracted teeth in postmenopausal osteoporosis rats. Methods 65 female SD rats were randomly divided into sham-operated, ovariectomy (given with physiological saline) and estrogen groups. The rats in ovariectomy and estrogen groups were ovariectomized to establish osteoporosis model. Eight weeks after surgery, the left maxillary first molar of all rats were extracted. The rats were killed at 7, 30, 60 days respectively after extracted surgery. Undecalcified sections of first molar extraction area were examined histologically by scanning electron microscope. Results There was no obvious difference in newly formed bone among three groups 7 days after extraction. 30 and 60 days after extraction both the structure and the mass of the newly formed bone decreased obviously in ovariectomy group than those in other two groups. During the period of bone wound healing a distinctive layer of bone tissue covered the entire length of residual ridge in ovariectomy group, being different from that in other two groups. Conclusions Osteoporosis might result in the different pattern of the newly formed bone and delay the time of bone wound healing, while estrogen could relieve the effect of osteoporosis.

　　【Key words】 Osteoporosis; Tooth extraction wound; Estrogen

　　系统性疾病可能影响剩余牙槽骨表面细胞表达，有研究表明绝经后骨质疏松可影响拔牙创的骨愈合〔1～3〕，加速了拔牙后剩余牙槽骨的骨吸收，减少剩余牙槽骨骨量，而雌激素替代治疗对骨质疏松状态下拔牙创骨愈合是否有一定的促进作用尚未见报道，本研究旨在从细胞超微结构观察雌激素对成年去势雌性大鼠拔牙创骨愈合的影响，为探讨雌激素治疗对骨质疏松患者拔牙创愈合影响的机制及其替代治疗减少拔牙后剩余牙槽骨吸收提供基础研究资料。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组 55只3月龄未交配SD雌性大鼠(西安交通大学医学动物实验中心提供)，国家A级实验动物,体重185～210 g，分笼饲养，同等条件下自由饮食，适应性饲养1 w后随机分为模型组35只，假手术组20只。去卵巢术后8 w，假手术组与模型组分别随机抽取5只大鼠断头法处死取全血及下颌骨行生化指标检测及组织学观察，模型组再随机分为模型组和雌激素组每组各15只，将每组分为拔牙术后第7、30和60天组，每组5只大鼠。

　　1.2 实验方法 无菌条件下采用腹部正中切口方式，全麻下切除模型组及雌激素组大鼠双侧卵巢，假手术组切除卵巢周围大小与卵巢相同的脂肪组织一块， 1 w后拆线。术前及术后8 w分别称取所有大鼠体重，同时雌激素组大鼠术后8 w始每3天皮下注射苯甲酸雌二醇(上海第九制药厂)20 μg/kg至实验结束，假手术组和模型组则同时注射等量生理盐水，并对所有大鼠行左侧上颌第一磨牙拔除术。在拔牙术后第7、30、60天，分别以过量乙醚处死大鼠，分离大鼠上颌骨， 10%福尔马林缓冲液固定。为了对牙槽骨表面进行扫描电镜观察，将固定好的上颌牙槽骨浸入5%次氯酸钠溶液中12 h溶去附着在颌骨和牙槽嵴表面的软组织，蒸馏水冲洗，1%四氧化锇溶液浸泡2 h。乙醇梯度脱水临界点干燥。喷金后，组织样品使用扫描电镜观察上颌第一磨牙近中根拔牙创口表面，并拍摄照片。

　　1.3 检测指标 处死大鼠时采血，在室温下凝固，3 000 r/min离心10 min，放免法检测血清雌二醇水平(试剂盒由天津九鼎鑫医学生物工程有限公司提供)。Leica Qwin V3版本彩色图像分析系统行下颌骨骨组织形态计量学测量。

　　1.4 统计学方法 数据以x±s表示，组间比较行t检验。

　　2 结果

　　2.1 造模8 w时各组大鼠体重、雌二醇及骨计量指标比较 造模8 w时模型组大鼠体重〔(311.3±15.6)g〕较假手术组〔(259.0±14.1)g〕明显增加(P<0.01);模型组雌二醇水平〔(21.67±3.12)ng/L〕较假手术组〔(70.26±5.13)ng/L〕明显降低(P<0.01)。模型组骨小梁宽度〔(61.57±21.03)μm〕明显低于假手术组〔(75.23±22.03)μm〕(P<0.05);模型组骨小梁间距〔(231.17±58.6)μm〕较假手术组〔(139.17±11.2)μm〕增大，且无显著差异;模型组骨小梁面积/视野面积百分比〔(15.3±2.3)%〕较假手术组〔(19.6±4.2)%〕降低，但无显著差异。

　　2.2 各组大鼠扫描电镜观察结果 ①假手术组大鼠于拔牙术后第7天，拔牙创的近中和颊侧可见少量新骨形成，其中层板样骨结构和骨细胞腔隙较明显;拔牙术后第30天，拔牙窝表面充满大量新骨，拔牙创口未完全愈合，新骨上可观察到明显的吸收陷窝。拔牙术后第60天，拔牙创近中几乎被层板样骨所充满，拔牙创的颊侧和近中面已被新骨充满，拔牙窝颊侧远中部分骨质仍较疏松。在腭侧边可见吸收陷窝形成的狭窄的腔隙，但更多的是层板样致密的新生骨(图1)。②模型组于拔牙术后第7天，在拔牙窝近中及颊侧可明显观察到由层板样骨组成的骨质疏松区域，其骨质疏松程度较假手术组明显且范围较大。高倍电镜可见拔牙窝内牙槽骨表面呈纤维条索状，与假手术组的相对较规律的层板样新生骨明显不同。拔牙术后第30天，拔牙窝近中已大部分充满层板样骨同时存在大量的骨吸收陷窝。拔牙窝周围骨质整体较假手术组明显疏松，腭侧远中区域骨质要较颊侧及腭侧近中骨质相对致密。高倍电镜可见牙槽窝周围骨质似鳞片状。拔牙术后第60天，拔牙窝未完全被新骨充满，该处的骨质明显疏松，薄纸状。骨吸收在拔牙窝的近中、颊侧较腭侧明显。高倍电镜牙槽骨表面纤维束状结构较其他两组略有差别，新生骨质明显纤薄。③雌激素组于拔牙术后第7天，拔牙窝内见少量新骨形成。新生骨较模型组致密。拔牙窝周围区域颊侧牙槽骨表面呈层板样骨，腭侧牙槽骨表面呈束状骨，与模型组拔牙窝周围区域牙槽骨表面呈纤维条索状表现完全不同。拔牙术后第30天，拔牙窝近中已大部分充满层板样骨，其新骨形成明显较模型组致密，颊侧和近中区域均可观察到骨质疏松区域，近拔牙创口处的牙槽骨表面骨吸收陷窝较模型组少，可观察到腭侧骨质较颊侧骨质致密。高倍电镜拔牙窝表面骨质与假手术组相似，但略显疏松。拔牙术后第60天，拔牙窝内基本为层板样新生骨充满。拔牙窝颊侧牙槽骨表面的骨质要较腭侧面骨质明显疏松。高倍电镜牙槽窝表面骨结构与假手术组相似(图1)。

　　图1 拔牙术后第7，30，60天各组拔牙创口处及拔牙窝周围牙槽骨情况(略)

　　3 讨论

　　3.1 骨质疏松动物模型建立 骨形成是动态骨重建过程，绝经后骨质疏松因雌激素缺乏使骨转换率增高,骨吸收大于骨形成,骨量丢失主要发生在松质骨,表现为骨小梁变细、变薄及断裂〔4〕。去卵巢大鼠模型目前被公认为是与临床最接近的绝经后骨质疏松动物模型〔5〕，我们通过测定血清中雌二醇含量及下颌骨骨计量学分析证实骨质疏松造模成功。

　　3.2 骨质疏松对颌骨和拔牙创骨愈合的影响 关于去势大鼠对全身骨组织和颌骨组织的影响，学者看法不一。多数学者认为，雌激素缺乏可导致全身骨组织和颌骨的疏松化改变，但全身骨吸收大于颌骨的吸收〔6，7〕。Li〔1〕等扫描电镜观察拔牙创愈合过程发现：幼年大鼠拔牙创愈合过程中模型组剩余牙槽嵴表面覆盖一层特殊的软骨样组织，且该组织只出现在模型组，病理切片未发现特殊的细胞参与骨形成，该作者认为该层骨组织的形成可能是由于不同全身条件下导致拔牙创骨形成的进度不同所致。Jahangiri等〔2〕从分子水平观察拔牙创骨愈合情况后认为假手术组拔牙创骨组织Ⅰ型胶原的表达较雌激素组和模型组要多，而雌激素组Ⅱ型胶原的表达较其他两组要高。以上研究提示我们大鼠全身状态的不同可能会导致拔牙创愈合过程中骨形成方式不同。

　　本研究扫描电镜观察表明骨质疏松可能导致拔牙创愈合过程中骨形成方式不同，对成年大鼠拔牙创骨愈合早期的影响较后期大，同时延长了拔牙创愈合时间。

　　3.3 雌激素应用对颌骨及拔牙创骨愈合的影响 雌激素治疗骨质疏松的机制尚不完全清楚，研究表明其影响骨代谢主要是通过下列3种途径：①通过成骨和破骨细胞上的雌激素受体，对骨密度有直接作用，增加骨形成，减少骨吸收。②通过细胞因子如白细胞介素1、白细胞介素6、肿瘤坏死因子和转化生长因子等，增加钙的吸收，降低骨钙丢失，间接抗骨质疏松。③通过骨保护因子作用机制和细胞凋亡机制，发挥抗骨吸收作用〔8〕。性激素替代治疗是目前国际上预防、治疗绝经后骨质疏松的首选疗法。

　　动物实验提示，切除卵巢造成骨质疏松模型的大鼠在雌激素治疗后，剩余牙槽骨出现成骨活动〔2〕。Civitelli 〔9〕等对135 名无明显牙周病的绝经期后妇女分别给予一定剂量的雌激素治疗和安慰剂对照，经过3年的跟踪调查，发现绝经后骨质疏松患者经雌激素替代疗法后，不仅全身骨组织的状况有所改善，而且还减缓了剩余牙槽骨骨质的吸收，增加了牙齿的保存率，有利于骨质疏松患者口腔骨组织的健康。

　　本研究提示雌激素治疗在减缓骨质疏松大鼠剩余牙槽骨骨质吸收同时，对骨质疏松大鼠拔牙创骨愈合也有一定影响。本观察表明在雌激素缺乏状态下所导致的拔牙创愈合时间延长且新生骨量减少，经补充雌激素后减缓了拔牙创骨质的吸收促进骨形成，并使骨质疏松大鼠拔牙创面新生骨形成方式与正常大鼠接近。其原因可能是：大鼠去势和局部伤害都加速了骨的转换,并增加了骨的形成〔3，10〕。这种局部组织伤害可加速骨转换并已被Frost 命名为“局部加速环境”〔11〕。导致拔牙创口的新骨形成方式与假手术组不同，而雌激素缺乏是造成拔牙创口骨愈合方式与假手术组不同的重要原因之一。因此使用雌激素替代治疗可减缓骨质疏松对拔牙创骨愈合的影响。

　　在本实验中，牙齿拔除可能会激活各种各样的生长因素，刺激成骨细胞分化和活动，另外，胶原蛋白、骨形成蛋白、转化生长因子等在骨组织中含量丰富，因此雌激素对骨质疏松大鼠拔牙窝的骨愈合有一定影响，其根本原因还有待于深入研究。

　　【参考文献】

　　1 Li X， Nishimura I.Altered bone remodeling pattern of the residual ridge in ovariectomized rats〔J〕.J Prosthet Dent，1994;72(3):324-30.

　　2 Jahangiri L， Kim A， Nishimura I.Effect of ovariectomy on the local residual ridge remodeling〔J〕.J Prosthet Dent， 1997;77(4):435-43.

　　3 Shimizu M， Sasaki T， Ishihara A，et al.Bone wound healing after maxillary molar extraction in ovariectomized aged rats〔J〕.J Electron Microsc (Tokyo)， 1998;47(5):517-26.

　　4 张 林,杨锡让,薛 延.不同强度运动对骨质疏松大鼠形态计量学的影响〔J〕.中国运动学杂志,1999;8(4):317.

　　5 陈 东,王连唐,陈国栋.去卵巢后大鼠不同部位的骨组织计量学与骨密度研究〔J〕.中国骨质疏松杂志,2002;8(3):208-10.

　　6 董福生，李增宁，董玉英，等.大鼠卵巢去势后颌骨与全身骨的形态学研究〔J〕.现代口腔医学杂志，2002;16(6):499-500.

　　7 赵献银，李晓红，朱晓姝，等.大鼠去势后对颌骨和股骨骨小梁结构的影响〔J〕.西安交通大学学报( 医学版),2004;25(3):285-7.

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　　9 Civitelli R，Pilgram TK，Doston M,et al.Alveolar and postcranial bone density in postmenopausal women receiving hormone/estrogen replacement therapy：a randomized，double-blind，placebo-controlled trial〔J〕.Arch Intern Med，2002;162(12)：1409-15.

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　　11 Frost HM.The biology of fracture healing.An overview for clinicians-Part Ⅰ〔J〕.Clin Orthop Relat Res,1989;248：283-93.