舌发育异常与胎鼠地塞米松腭裂的关系

　　作者：刘贤 吴靖芳 安 峰 作者单位：1.河北北方学院临床医学本科2005级6班，河北 张家口 075000;2.河北北方学院医学院组胚教研室，河北 张家口 075000;3.河北北方学院口腔系，河北 张家口 075000 张家口市科学技术研究与发展指令计划(编号：061156)

　　【摘要】 目的：本实验通过小鼠胚胎腭裂模型制备，探讨地塞米松对胎鼠舌体高度、宽度及舌肌黏膜厚度的影响。方法：选取孕鼠30只，随机分为对照组和实验组，实验组于11.5GD腹腔注射地塞米松，对照组注射等量生理盐水。获取13.5GD～16.5GD的腭裂胚胎模型，取其头部Bouins液固定，石蜡包埋，标准颅颌冠状位5μm连续切片，进行HE染色和bcl2免疫组化染色。光镜下进行形态学测量并对所得数据进行统计学分析。结果：1.bcl2阳性信号呈棕褐色颗粒，存在于核膜周围及胞浆中。2.实验组、对照组中不同时期横行舌肌与纵行舌肌数量比例不同，13.5GD纵行舌肌数量较多，16.5GD横行、垂直舌肌数量较多。3.同一时期，实验组舌体高度明显高于对照组。结论：地塞米松诱导的胎鼠腭裂的发生与舌发育异常有关，而且舌体高度在一定程度上参与了腭裂的形成过程。

　　【关键词】 腭裂;小鼠;地塞米松;舌肌;bcl2

　　小鼠腭裂的形成受多方面因素的影响，其中胎鼠腭发育的异常、舌发育的异常等均参与了腭裂的形成过程。其中胎鼠腭发育的异常我们已研究过[1,2]，本实验重点探讨舌的发育过程及其发育异常对腭裂形成的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验试剂与器械

　　试剂：醋酸地塞米松、Bouins固定液、苏木精—伊红染液、兔bcl2多克隆抗体、即用型SABC免疫组化试剂盒(武汉博士德生物有限公司)。

　　仪器：OLYNPUS CX31，Motic 6.0医学图像分析系统。

　　1.2 实验动物与方法

　　健康成年未生育昆明小鼠，体重22～25g，北京大学医学部实验动物中心提供，下午6∶00雌雄2∶1合笼，次日早7∶30和下午4∶30检查阴栓，发现阴栓之日定为孕期第0天(0GD，gestation day)。所得孕鼠随机分为实验组、对照组。实验组孕鼠于11.5GD腹腔注射50mg/kg剂量的地塞米松，对照组注射等量生理盐水。各组均在13.5GD、14.5GD、15.5GD、16.5GD颈椎脱臼处死，取出胚胎，共得到胎鼠284只，其中实验组196只，对照组98只。取头Bouin's液固定，以喙部向下做定向石蜡包埋、5μm连续冠状位切片。

　　1.3 染色

　　HE染色：二甲苯脱蜡、梯度酒精、蒸馏水洗。苏木精染色5min、盐酸—酒精分化、伊红染色2min、梯度酒精脱水、二甲苯透明、封片。

　　免疫组化染色：常规脱蜡至水;抗原修复3min;0.01mmol/L PBS液洗3min×3次;3%H2O2 室温避光孵育15min;0.01mmol/L PBS液洗3min×3次;5%BSA封闭。加入bcl2(1∶100)，湿盒中4℃孵育过夜。其他步骤按即用型SABC免疫组化试剂盒使用说明书进行。苏木精复染，盐酸—酒精分化、蓝化、脱水、透明、封片。光镜观察舌体高度、舌体宽度及舌黏膜厚度的变化。

　　1.4 数据处理

　　用OLYMPUSCX31显微镜连接在计算机上进行观察：各组中每只动物随机选取同一解剖平面，10倍目镜下统计测量舌体高度、舌体宽度及舌黏膜厚度，以SPSS统计软件进行ANOVA方差分析。

　　2 结果

　　2.1 舌体的形态学观察

　　舌由表面的黏膜和深部的舌肌组成。舌肌由纵行、横行及垂直走向的骨骼肌纤维束交织构成，纵行肌所占比例最多，垂直肌次之，横行肌最少。在舌的不同生长发育阶段，舌肌的纵行、横行及垂直走行的骨骼肌纤维束组成比例不尽相同。13.5GD时舌体中央可见较多的星状、纺锤状细胞，舌肌未完全分化。正常组14.5GD时在靠近舌背面侧可见到核圆形的舌肌纤维横断面，舌体开始下降;在15.5GD时舌体继续下降，双侧腭突水平相向生长;在16.5GD时舌降至口底，舌发育基本完成。实验组与正常组发育过程相似，但部分个体发育延迟(图1～2)。13.5GD时纵行肌占较大比例，14.5GD、15.5GD时垂直肌所占比例不断增加。由13.5GD到14.5GD时，舌肌细胞由密集变得稀疏，14.5GD,15.5GD,16.5GD舌肌纤维密度几乎无差别。但实验组HE染色切片中，胞浆及细胞外基质较多，染色淡，舌肌纤维粗大肥厚(图3～4)。各时期bcl2阳性信号的表达无明显变化。

　　2.2 舌体变化

　　13.5GD两组胎鼠舌体厚，呈矢状位生长;正常组14.5GD以后舌体变扁宽，而实验组则呈现不同程度的发育迟滞。实验组与对照组比较，实验组舌体高度明显高于对照组。对照组中舌体高度随孕期日的增加而逐渐降低，16.5GD时舌体已完全降至口底，与成年小鼠的舌体相似。实验组中舌体高度亦随孕期日的增加而逐渐降低，13.5GD时实验组与对照组无明显差别。实验数据经SPSS10.0软件ANOVA方差分析,结果如表1。 2009年6月刘 贤等：舌发育异常与胎鼠地塞米松腭裂的关系表1 实验组和对照组阳性舌体高度比较 注：与对照组相比*P<0.05，**P<0.01

　　3 讨论

　　腭发育是一个复杂的过程，遵循一定的规律，并呈现精密的时间空间关系，包括细胞的增殖、分化、凝聚等过程，同时受其它外界与内部因素的影响。胚胎期腭突发育大致可分为五个时期：腭突发生期、垂直生长期、水平生长期、接触融合期和分化成熟期[3]。我们观察到舌发育在一定程度上影响了腭的发育，参与了腭裂的形成。本实验中的13.5GD、14.5GD分别相当于上述的腭发育的垂直生长期和水平生长期，两个时期的过渡需要经过腭的上抬，而腭的完全上抬变为水平向生长在一定程度上受舌体下降程度的影响。舌体的下降延迟或不完全下降，阻碍了双侧腭突水平方向的生长，以致不能在中线区融合，最终导致腭裂的产生。我们发现13.5GD～16.5GD对照组和实验组，舌体高度均逐渐下降;在13.5GD实验组和对照组中舌的高度无明显差别，但在14.5GD～16.5GD三个时期的对照组与实验组中，舌体高度具有显著性差异(P<0.05，P<0.01)。实验组中舌体的下降相对延迟，导致舌体较高，影响腭的上抬及水平方向的生长，导致腭裂的产生。据此我们可以认为舌体的下降延迟参与了腭裂的形成过程。

　　舌由表面的黏膜和深部的舌肌组成，舌肌由纵行、横行及垂直的骨骼肌纤维束交织构成，黏膜由复层扁平上皮与固有层组成。本实验中我们可以观察到：在舌的不同生长发育时期舌的纵行、横行及垂直的骨骼肌纤维束的组成比例是不全相同的。从13.5GD～16.5GD舌垂直肌的比例有所上升，13.5GD时舌肌纵行肌的比例最高。Takeshi Hirao等[4]认为大鼠在13GD时下颌突、侧舌突不能明显区分，舌前部有细胞聚集现象。在14GD时舌的基本形态形成，可区分出下颌突和舌。在15GD时下颌突完全形成，舌间充质细胞变为星状、纺锤状并聚集于舌中央形成有规则的舌肌样组织。在16GD时鼻和口腔被侧腭突分开，舌体下降，间充质分化为具有特殊排列形式的横行、纵行、垂直舌肌，舌的形态类似于成年大鼠。在17GD时舌的上皮组织、舌肌组织、血管进一步分化。在18GD～19GD 时舌背面上皮迅速增生为5～6层，骨骼肌细胞增生。在20GD时上皮角质化，肌周围血管发育成熟，舌的发育基本完成。大鼠发育的15 GD 相当于小鼠的13.5GD ～14GD，15.5GD相当于14.5GD，16GD相当于15GD，17GD～18GD相当于小鼠的16GD ～16.5GD[5]，本实验中我们观察到：小鼠在13.5GD时舌体中央可见较多的星状、纺锤状细胞;在14.5GD时在靠近舌背面侧可见到核圆形的舌肌细胞，舌体开始下降;在15.5GD时舌体继续下降，双侧腭突水平相向生长;在16.5GD时舌降至口底，舌发育基本完成。这与Takeshi Hirao等[4] 研究结果一致。另外，我们观察到舌体的下降与舌体的高度和宽度有关，舌体体积比较大时舌的下降可能受到影响。组织切片染色后我们观察发现舌体骨骼肌肌束数量并未增多而是细胞浆、细胞外基质增多，舌肌纤维粗大肥厚，但肌浆着色浅于对照组。这与Kobayashi[6]等文献报道一致。据此我们可认为舌肌纤维粗大肥厚导致舌肌收缩无力，影响了舌体的下降，参与了腭裂的形成。我们又观察到的bcl2阳性细胞数密度无明显改变，也说明舌的下降延迟与肌纤维凋亡关系不大。因此我们认为舌肌细胞的凋亡与增殖并未参与腭裂的形成过程。

　　综上所述，舌体的发育异常在一定程度上影响了腭的发育，与腭突的发育异常共同导致了胎鼠腭裂的发生。

　　【参考文献】

　　1 刘贤,齐志丽,刘杨,等.地塞米松诱导小鼠腭裂动物模型的建立[J].河北北方学院学报(医学版),2008,25(3):2124

　　2 田悦明,刘贤,刘杨,等.地塞米松对小鼠腭突细胞增殖和分布的影响[J].河北北方学院学报(医学版),2008,25(4):1316

　　3 于世凤.口腔组织病理学[M].第5版.北京：人民卫生出版社，13:14

　　4 Takeshi H, Tsuyoshi S, Jingo K,et al.Angiogenesis and developmental expression of vascular endothelial growth factor in rat lingual papillae[J].Kurlume Med J,2007,54(12):924

　　5 俞慧珠,叶百宽.小白鼠胚胎发生[M].北京:科学出版社,1985,17:26

　　6 Kobayashi A,likubo M,Kojima I,et al.Morphological and Histopathological Changes of Experimentally Developed Acromegalyliked Rats [J]. Horm Metab Res,2006,38:146151