雷公藤内酯醇对Tca 8113细胞增殖周期进程的影响

　　作者：韩成敏 陈宏勃 张卓 作者单位：吉林大学白求恩口腔医院，吉林 长春 130021

　　【摘要】目的 观察雷公藤内酯醇(TL)对体外培养的人舌癌细胞系Tca8113细胞诱导分化机制，为人舌癌治疗提供理论依据。方法 应用噻唑蓝(MTT)比色法检测不同浓度的TL对Tca8113细胞的增殖抑制率，相差显微镜观察细胞形态学改变，流式细胞仪检测Tca8113细胞周期进程改变及凋亡率，电子显微镜观察经TL作用后的Tca8113细胞超微结构改变。结果 TL对Tca8113细胞的增殖抑制率呈明显的剂量依赖性，相差显微镜下实验组细胞贴壁不佳，并且数目减少，细胞圆缩。流式细胞仪结果显示G1期细胞增多，S期细胞减少，G2/M期细胞增多，细胞凋亡率升高。电子显微镜下可见细胞高度空化，线粒体肿胀，细胞核染色质趋边，可见凋亡小体。结论 TL对Tca8113细胞有显著的增殖抑制作用，阻止Tca8113细胞G1期向S期转化进程，诱导Tca8113细胞凋亡及亚细胞结构改变。

　　【关键词】 Tca8113细胞;雷公藤内酯醇;细胞周期;凋亡

　　近年来研究发现雷公藤内酯醇(tritolide，TL)对于人与动物多种肿瘤细胞在体内外具有较强的抗肿瘤作用〔1〕。但对头颈部肿瘤的作用尚未见报道。本研究观察不同浓度的TL对舌癌Tca8113细胞增殖周期各时相的影响及凋亡率，为人舌癌的治疗提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞及试剂

　　Tca8113细胞(北京医科大学口腔医院);噻唑蓝(MTT)及RPMI1640培养基(美国Sigma公司)，TL(中国药品检测所)，胎牛血清(长春生物制品研究所)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 MTT比色法

　　取对数生长期的Tca8113细胞，经0.25%胰蛋白酶消化，调细胞数为2×105/ml，接种于96孔塑料培养板内，每孔100 μl，当细胞增殖达到80%汇合时分组，分别加入1、3、5 μg/ml TL溶液，每个浓度10复孔，同时设空白对照组，静止培养24 h，于结束前6 h加入MTT试剂20 μl/孔，终浓度为500 mg/L，继续培养6 h后，吸弃上清，加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl/孔，振荡10 min，使MTT还原产物完全溶解，酶标仪于570 nm处测定各孔吸光度A值，按公式计算Tca8113细胞增殖抑制率：Tca8113细胞抑制率=(1-加药组细胞A值/对照组细胞A值)×100%

　　1.2.2 流式细胞术

　　细胞培养及分组同1.2.1，不同之处是将96孔培养板改为25 ml培养瓶进行，培养结束后经0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞，PBS洗2次，70%冷乙醇固定，上机前调细胞数为1×106/ml，PI染色，流式细胞仪检测，细胞周期结果以Modifi2.0软件分析。

　　1.2.3 透射电镜

　　细胞培养及分组同1.2.2，分别收集经不同浓度TL作用的Tca8113细胞，移入锥型离心管内，离心弃上清，2.5%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，环氧树脂包理，超薄切片，醋酸铅铀双重染色，透射电镜观察并拍照。

　　1.3 统计学处理

　　所有实验数据以x±s表示，采用SPPS11.0软件，细胞生长抑制率组间比较采用χ2检验，细胞周期比值组间比较用F检验。

　　2 结 果

　　2.1 不同浓度TL对Tca8113细胞增殖的抑制作用

　　TL可明显抑制Tca8113细胞的增殖，不同浓度的TL与Tca8113细胞共孵育24 h后，相差显微镜可见对照组细胞生长旺盛，细胞发亮，折光性强，而实验组细胞圆缩，贴壁不佳，细胞数目变少，且随着药物浓度的升高细胞改变越明显，具有显著的剂量依赖性。显示不同浓度的TL对Tca8113细胞增殖抑制率均有影响，组间比较差异显著。见表1。不同浓度TL对Tca8113细胞周期各时相均有影响，G1期细胞增多，S期细胞减少，G2/M期细胞相对增多，凋亡率上升，组间比较差异显著。见表2。表1 不同浓度的TL对Tca8113细胞增殖抑制率的影响(略)表2 不同浓度的TL对Tca8113细胞周期各时相及凋亡率的影响(略)

　　2.2 不同浓度TL对Tca8113细胞超微结构改变

　　见图1。1 μg/ml TL诱导Tca8113细胞线粒体肿胀，有空泡形成;5 μg/ml TL诱导Tca8113细胞后，核染色质趋边凝集，可见凋亡小体。

　　3 讨 论

　　TL是从卫柔科植物雷公藤中提取的一种主要活性成分，有抗癌、抗肿瘤、抗免疫排斥、抗菌等作用〔2〕。且能与多种化疗药物协同作用，强化化疗效果或逆转肿瘤细胞耐药。

　　本研究应用MTT染色法检测不同浓度TL对Tca8113细胞的增殖抑制率收到了较为满意的结果，抑制率分别为28.3%、33.9%和47.6%，具有明显的剂量依赖性，组间比较差异显著。MTT试剂可被哺乳动物活细胞线粒体中的脱氢酶还原成蓝色甲臜颗粒，且甲臜生成的量与活细胞数量及细胞活化状态成线性关系，具有一定的客观性。因此被广泛用于抗肿瘤药物的筛选和细胞毒性实验研究。

　　流式细胞仪显示不同浓度的TL对Tca8113细胞周期各时相均有影响。结果显示G1期细胞增多、S期细胞减少，G2/M期细胞相对增多。文献报道，TL能使细胞静止于G1期、不能进入S期，从而造成S期细胞明显减少，细胞发生凋亡〔3〕。G1期细胞又称细胞复制前期，是细胞从有丝分裂到DNA复制之前，G1期制造和产生rRNA、mRNA、tRNA及核蛋白体，同时G1期糖元合成最为显著，而且G1期也是化学药物作用的敏感点〔4〕。因此，抑制细胞周期G1期RNA及核蛋白体的合成，可间接地使肿瘤细胞的RNA合成减少。细胞周期是一个复杂的过程，在各种细胞周期调节因子的严格控制下，任何一个环节失控即可发生形态等改变，实验结果显示TL可明显阻滞G1期细胞向S期的转化进程，G1期细胞堆积，造成S期细胞减少，从而使G2/M期细胞相对增多，G2/M期细胞增多是细胞损伤的普遍反应〔5〕。这一点从细胞凋亡率上得到了体现。

　　此外，应用相差显微镜和电子显微镜观察TL作用后Tca8113细胞形态学改变，相差显微镜下可见不同浓度的TL均可使Tca8113细胞形态改变，细胞数减少，细胞圆缩、贴壁不佳，而电子显微镜下Tca8113细胞高度空化，线粒体肿胀，核染色质趋边凝集，可见凋亡小体。总之，TL对Tca8113细胞有较强的增殖抑制作用，是一种比较有前途的抗肿瘤新药。

　　【参考文献】

　　1 宁维翔，顾江红.雷公藤内酯醇抗肿瘤作用研究进展〔J〕.国际肿瘤杂志，2006;33(1):269.

　　2 丁晓凌，周国雄.雷公藤内酯醇诱导肿瘤细胞凋亡的机制〔J〕.国际肿瘤学杂志,2006;33(4):25961.

　　3 Yang S，Chen J，Guo Z,et al.Triotolide inhibits the growth and metasis of solid tumors〔J〕.Mol Cancer Ther,2003;2(1):6572.

　　4 Brtek J，Lukas J.Mammalian G1 and Sphase checkpoints in response to DNA damage〔J〕.J Curropin Cell Biol,2001;13(6):73847.

　　5 Ellinger Ziegelbauer H，Karasuyama H，Yamada E,et al.S te20Like Kinase(SLK),a regulatory Kinase For pololike(PIK)durinh the G2/M transition in somatic cells〔J〕.Genes Cells,2005;5(6):4918.