压力与牙周膜细胞对体外诱导脐血单核细胞分化为破骨样细胞的影响

　　作者：吴承琼，周洪，王晓荣 作者单位：西安交通大学医学院附属口腔医院正畸科;口腔医学研究中心，陕西西安 710004

　　【摘要】目的 研究持续静压力和人牙周膜细胞对体外诱导脐血单核细胞分化为破骨样细胞的影响，初步探讨静压力和牙周膜细胞在正畸性骨改建中的作用机制。方法 密度梯度离心法分离脐血，收集单个核细胞。用组织块酶消化法培养获得牙周膜细胞。建立transwell共培养系统，下层接种脐血单个核细胞，上层接种牙周膜细胞。A组为单核细胞与牙周膜细胞共培养加力;B组为单核细胞培养加力，另设不加力对照组A’、B’组。采用倒置相差显微镜观察及TRAP染色，骨磨片染色等方法检测破骨样细胞的形成及功能。结果 A组下层细胞在加力后第2天出现细胞融合现象，3d时可见明显的多核破骨样细胞，TRAP染色阳性，骨磨片染色可见典型的骨吸收陷窝。其他组仅有极少量多核细胞形成，未见骨吸收陷窝。结论 静压力作用下，牙周膜细胞可以刺激脐血单核细胞分化为破骨样细胞。

　　【关键词】 脐血单核细胞 牙周膜细胞 持续静压力 破骨样细胞

　　Effect of continuously compressive pressure and humanperiodontal ligament cells on the differentiation ofosteoclastlike cells in vitro

　　WU Chengqiong, ZHOU Hong, WANG Xiaorong

　　Orthodontic Department, the Affiliated Stomatological Hospital, Medical School of

　　Xian Jiaotong University, Research Center of Stomatology, Xian 710004, China

　　ABSTRACT: Objective To study the effect of continuously compressive pressure (CCP) and human periodontal ligament cells (HPDLCs) on the differentiation of osteoclastlike cells (OLC) induced from umbilical cord blood cells in vitro, and to investigate the role of continuously compressive pressure and human periodontal ligament cells in alveolar bone rebuilding during orthordontic tooth movement. Methods Mononucleared cells of umbilical cord blood (HCMNCs) were separated by density gradient centrifugation, HPDLCs were isolated from human periodontal ligament by explanting enzymatic digestion with trypsin and collagenase. We also established transwell coculture system with HCMNCs in the lower layer and HPDLCs in the upper layer. Group A: HCMNCs and HPDLCs were cocultured with 150kPa CCP for 1.5 hours on the model. Group B: only HCMNCs were cultured with the same CCP as Group A. Groups Aand B were the respective control group of Groups A and B with no CCP exerted. The cell appearance was observed under the phase contrast microscope, and its identification was performed by histochemical analysis of tartraterresistant acid phosphatase (TRAP). The capacity of bone resorption of the cell was assessed by lacunae forming ability on bone slice. Results HCMNCs in Group A began to fuse on the 2nd day, More positive multinucleated cells could be seen with TRAP staining and cortical bone pit formation on the 3rd day. Only a few multinucleated cells formed in the other groups, with no cortical bone pit formation. Conclusion HCMNCs can fuse into multinucleated OLC under CCP with the induction of HPDLCs.

　　KEY WORDS: mononucleared cell of umbilical cord blood; human periodontal ligament cell; continuously compressive pressure; osteoclastlike cell

　　正畸牙移动是一个复杂的机械生物学反应过程，牙周组织感应力学刺激后所发生的组织改建是牙齿移动的基础。破骨细胞(osteoclast, OC)是骨吸收的最重要的功能细胞，来源于血液中的单核巨噬细胞系[1]。它通过分泌酸和蛋白酶，溶解骨矿，降解胶原，从而启动骨吸收。FUJIKAWA等[2]证实在人外周血中存在破骨细胞前体细胞，而脐血更为原始，存在着更多的单核细胞或前体细胞[3]，可用于诱导破骨样细胞。人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells, HPDLCs)位于牙周膜，是感受正畸力并引起齿槽骨改建的效应细胞[4]。国内外研究证明HPDLCs表达的核因子受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand, RANKL)在破骨细胞的分化与活化中起着重要作用[56]。黄生高等[7]的实验证实，持续静压力可以上调HPDLCs中的RANKL的表达。因此，我们推测，持续静压力作用下，牙周膜细胞可以诱导脐血单核细胞分化为破骨样细胞。本实验通过建立静压力下牙周膜细胞与单核细胞共培养体系，观察破骨样细胞的形成及活化情况，从而探讨持续静压力及牙周膜细胞在破骨样细胞生成及活化过程中的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂与仪器

　　主要试剂有：αMEM培养基(Gibco公司);胎牛血清(浙江金华生物制剂公司);人淋巴细胞分离液(天津灏洋公司);萘酚ASBI磷酸盐(Sigma);Hanks平衡盐溶液(实验室配制)，Ⅰ型胶原酶(Sigma)。主要仪器有：全自动高压灭菌锅HV50 (HIRAYAMA);低温高速离心机(3K18) (Sigma);倒置显微镜(Nikon);CO2培养箱(BB16) (Heraeus);超净工作台(BCM100A) (中国苏州);空气静压力细胞加载系统(自制)。

　　1.2 玻片及骨磨片的处理

　　将1.0cm×1.0cm大小的盖玻片超声清洗后浸入硫酸重铬酸钾溶液中浸泡过夜后，将盖玻片清洗干净，高压灭菌后备用。取新鲜牛股骨干密质部分，制备成0.5cm×0.5cm厚50～100μm的骨片，超声清洗3次，每次10min。蒸馏水冲洗干净，浸入含10倍双抗的Hanks溶液中存放于-20℃备用。

　　1.3 HCMNC的分离培养

　　取健康产妇抗凝脐血50mL，用等体积培养液稀释并混匀;将稀释血液以体积比1∶1沿管壁轻轻加于淋巴细胞分离液的液面上，形成清晰的分离界面;2000r/min离心20min，轻轻吸取呈云雾状的白膜层(主要含单个核细胞)，收集于离心管内;用Hanks液洗3次，1500r/min离心5min，弃上清，用αMEM培养液(含FBS 150mL/L)重悬计数，调整细胞浓度为3×106/mL，接种于预置骨片和盖玻片的transwell培养板下室和24孔培养板，37℃、50mL/L CO2培养箱内培养2h后全量换液。以后每3d半量换液。

　　1.4 HPDLCs的培养与鉴定

　　取西安交通大学口腔医院口外门诊12～18岁健康青少年因正畸拔除的第一前磨牙，刮取牙根中1/3的牙周膜组织后剪碎，1200r/min离心5min，弃上清，加入2g/L的I型胶原酶1～2mL，吹打混匀，置于37℃恒温箱中消化30min，每隔5min振荡摇匀一次。当肉眼观察到液体浑浊，组织块明显变小时加入含FBS 150mL/L的DMEM培养液终止消化，1200r/min离心5min，弃上清，加入DMEM培养液重悬后置于塑料培养瓶中，37℃、50mL/L CO2培养箱中培养。24h后加培养液至3mL，获得原代细胞。每3～4d换液。将细胞传至第4代备用，以波形丝蛋白抗体和角蛋白抗体染色鉴定细胞。

　　1.5 共培养模型的建立与加力

　　实验分4组：A组为共培养加力组，transwell共培养上室放置HPDLCs，密度5×104/mL，下室放置HCMNC，密度1×106/mL，置于37℃、50mL/L CO2培养箱内培养2d后全量换液，12h后置于预先消毒的压力加载装置的密闭容器里，150kPa，加压1.5h。B组为单核细胞加力组，将HCMNC以1×106密度接种于24孔培养板，细胞培养及加力条件同A组。分别设A、B组的不加力对照组A’组、B’组。

　　1.6 细胞形态学观察

　　倒置相差显微镜观察各组细胞的生长情况及形态变化。

　　1.7 TRAP染色

　　将细胞爬片用体积分数25mL/L的戊二醛4℃固定10min，蒸馏水洗3次;放入TRAP染色液37℃孵育50min。蒸馏水洗3次，甘油明胶封片，光镜观察。

　　1.8 骨吸收陷窝观察

　　取各培养组的骨片经25mL/L戊二醛液4℃固定7min，0.25mol/L氢氧化铵超声清洗3次，每次1min，梯度乙醇脱水，自然晾干，10mL/L甲苯胺蓝染液室温染色4min，蒸馏水洗后光镜下观察。

　　2 结 果

　　2.1 细胞形态学的观察

　　2.1.1 HPDLCs的培养

　　第4代的HPDLCs生长旺盛，呈长梭形，胞浆丰富，贴壁生长，呈栅栏排列(图1A)。波形丝蛋白染色呈阳性，胞浆棕黄色着色;角蛋白染色阴性(图1B)。

　　2.1.2 HCMNC的培养

　　培养2h后，部分细胞贴壁，换液去除淋巴细胞，贴壁的HCMNC胞体呈圆形，胞浆透光，核居中(图2A、3A)。

　　2.1.3 加力后细胞形态的观察

　　A组：HPDLCs生长良好，少数细胞变圆(图1C);HCMNC加力2d后细胞变大、变圆，可见部分细胞融合现象;3d时可见明显的多核OLC;5d时多核OLC数目增多，胞体变大，胞核3～10个不等，有的细胞可见伪足(图2B～2D)。B组：HCMNC培养第2天时细胞形态及数目未见明显变化;培养第5天后，细胞数目减少，可见极少量细胞融合现象;培养第7天，可见很少量的细胞融合，但胞体较A组小，且胞核少(图3B～3D)。

　　2.2 TRAP染色的结果

　　A组下层细胞3d时可见TRAP染色阳性的OLC，胞体变大，胞核多在3个以上。第7天时，TRAP(+)的OLC数量增多，胞体明显变大，胞核增多，出现10个以上细胞核的细胞。B组细胞7d时做TRAP染色，仅见少量的细胞阳性染色，胞体较A组小，胞核较少(图4A～4D)。A组、B组单核细胞染色结果基本上与B组相同。

　　2.3 骨吸收陷窝的观察

　　取各组培养3d和7d后的骨片，经甲苯胺蓝染色后观察骨吸收情况，A组培养3d后的骨片开始出现骨吸收，培养7d后的骨片可见典型的骨吸收陷窝。B组培养3d和7d后的骨片均未观察到典型的骨吸收陷窝，A组和B组的骨片染色结果与B组的相同(图5A～5C)。

　　3 讨论

　　破骨细胞分化的调节是一个多因素、多层次、多环节的网络系统[89]，国内外研究认为，当牙齿受到正畸力时，牙周膜细胞能将所受到的机械应力转化为细胞内外的生物化学信号，并分泌释放多种细胞因子及生长因子，同时参与骨吸收和骨形成的过程。然而，以往的研究多是对牙周膜细胞和破骨细胞单独培养，分别研究应力作用下的反应，不能直接研究牙周膜细胞对破骨细胞特异性诱导作用。本实验建立了体外人牙周膜细胞和脐血单核细胞共培养模型并加力，模拟正畸牙齿移动的力学效应过程，在一定程度上真实地反应了牙槽骨改建过程中两种细胞的受力后相互作用的情况。

　　共培养方式分直接接触和间接接触。本实验选用间接接触方式，将人脐血单核细胞与牙周膜成纤维细胞通过transwell小室建立共培养体系，上层接种牙周膜细胞，下层接种单核细胞，上下两室相距1.0mm，两种细胞不接触而培养液相通，这样能够更好地研究两种细胞间的相互作用和各自相关因子的变化，接近牙周膜微环境中两种细胞的存在方式。TAKAHASHI等[10]认为前体破骨细胞需要与牙周膜细胞直接接触才能分化为破骨细胞，而本实验通过对间接接触的两种细胞施加持续静压力，获得大量TRAP(+)的破骨样细胞，且具有骨吸收功能。说明牙周膜细胞对破骨细胞的前体细胞作用可能是通过分泌细胞基质或各种因子来发挥作用的。

　　细胞动力学是现代生物力学发展的前沿领域，其研究基础和关键是细胞加载技术。1939年，GLUCKSMANN在体外细胞力学加载方面，进行了开拓性的研究。1975年RODAN等开创了机械应力作用培养细胞和组织相关研究的新时代，经过多年的改进和发展，已研制出多种体外细胞加力装置。大致分为：离心力加载、流体加载、单个细胞加载、压力传导加载、基底膜形变加载和空气静压力加载等装置。本实验选择由Banes设计的真空操作装置并加以改良，解决了以往对体外细胞加力方法不足的问题。该装置可以提供静压力和间歇性可变压力两种方式，在气体静压力作用下，每个细胞受力大小均匀，压力值肯定，压力调节范围大，且操作简单，是一种较为理想的加力装置。体外细胞力值加载的大小一直是学者们争论的热点。CARANO认为当空气静压力加至400kPa时细胞受到不可逆损害。本课题组前期的试验结果表明，人牙周膜细胞在静压力下分泌破骨细胞形成的细胞调节因子表达增高。推测静压力对牙周膜细胞在诱导破骨细胞分化和骨吸收过程中起到作用，适宜的静压力条件是100～150kPa，1.5h。本实验采用150kPa，作用1.5h，两种细胞均生长良好，且形成大量破骨样细胞。

　　破骨细胞的信号转导通路是一个错综复杂的网络系统，牙齿受到正畸力后，可激活多条信号通路，刺激血缘性单核细胞分化发育为成熟破骨细胞，主要通路有[1112]：肿瘤坏死因子及其受体通路，白介素及其受体通路，RANK通路等。其中，RANK通路是破骨细胞分化成熟最重要的调节系统[13]。破骨细胞内与RANK相关的信号通路有多条，而且每条之间又相互调节，给研究带来困难。

　　TAKAYANAGI[14]首次提出，激活T细胞核因子(NFATc1)可能是调控破骨细胞终末分化的总开关。RANK激活后主要通过TRAF6和cfos两条通路诱导NFATc1表达。目前，国外研究认为NFATc1[1516]是破骨细胞分化成熟最关键的转录因子，RANK激活后，主要通过激活P38MAPK来激活下游转录因子NFATc1，从而启动破骨细胞的分化。然而，其具体调控机制仍不清楚。

　　课题组前期实验证实当牙周膜细胞受到持续静压力时，细胞表达RANKLmRNA增强;本实验结果显示：当对共培养的人牙周膜细胞和脐血单核细胞施加持续静压力时，产生了大量具有骨吸收功能的破骨样细胞，且与对照组差异显著。结合本实验与前期实验结果，我们认为：RANKL作为破骨细胞分化与成熟的重要调节因子，与破骨前体细胞(即单核细胞)表面受体RANK结合，进而激活多条信号转导通路，刺激单核细胞分化发育为成熟破骨细胞。压力作为一种骨吸收刺激信号，牙周膜细胞作为刺激信号的感应细胞和效应细胞，在正畸性骨吸收中起着重要的作用。

　　本实验初步建立了人牙周膜细胞与脐血单核细胞共培养加力模型，为体外细胞培养技术提供了新思路;为进一步研究压力刺激下，牙周膜细胞诱导破骨细胞生成的信号转导通路奠定了基础;对于临床工作中提高治疗效果、缩短治疗时间也有着重要的指导意义。

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