诱导型一氧化氮合酶在动物颞下颌关节软骨组织中的定位表达

　　作者：李鹏 王大章 高占巍 作者单位：314000 浙江省嘉兴市第一医院　610041 四川大学华西口腔医学院100029 北京中日友好医院

　　【摘要】 目的 探讨颞下颌关节骨关节病(TMJOA)病变发展的不同阶段，诱导型一氧化氮合酶(iNOS)在软骨组织中的表达强度及在组织中的定位。方法 8只山羊分为4组。首先采用1%胶原酶注射山羊关节腔，建立TMJOA动物模型。注射胶原酶后第2、4、12、24周，分别处死2只动物。免疫组化法检测iNOS在TMJOA关节软骨组织中的表达情况。 结果 对照组无iNOS表达，各实验组在软骨组织中均有iNOS表达。病变中期iNOS表达强烈，提示NO与软骨的破坏有关。在病变后期，iNOS的表达逐渐变弱。 结论 iNOS在TMJOA发生发展的过程中起着重要的作用。

　　【关键词】 颞下颌关节 骨关节病 诱导型一氧化氮合酶

　　【Abstract】 Objective To determine the strength and location of iNOS's expression in goat collagenase-induced osteoarthrosis. Methods 8 goats were induced osteoarthrosis (OA) with collagenase in temporomandibular joint (TMJ). At 2, 4, 12, 24 weeks after injection, 4 joints of two goats were dissected respectively, the expression of iNOS was examined immunohisochemically. Results The expression of iNOS was detected in cartilage, especially high in middle stage of disease, and no expression in the normal TMJ of the goat. Conclusions iNOS plays an important role in TMJOA's pathogenesis.

　　【Key words】 Temporomandibular joint Osteoarthrosis Inducible nitric oxide synthase

　　骨关节病(Osteoarthrosis，OA)，又称骨关节炎(Osteoarthritis)是系包括颞下颌关节(Temporomandibular joint，TMJ)在内的所有滑膜关节均常见的一种非炎症性退行性病变。

　　已有研究证实，一氧化氮(NO)在TMJOA中起着重要的作用。人离体软骨细胞，在致炎细胞因子和(或)细菌脂多糖(LPS)刺激下，均能显著表达诱导型一氧化氮合酶(iNOS)，NO的合成也显著增加。高浓度NO可促进软骨细胞凋亡，抑制软骨细胞增殖，促进软骨基质分解，产生退行性变，逐渐发展进入OA的病理过程[1]。作者自2001至2005年研究揭示TMJOA病变发展的不同阶段，iNOS在软骨组织中的表达强度及在组织中的定位。进一步探讨NO及iNOS在TMJOA发生发展过程中的作用与机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物分组 实验选用四川简阳产无角骟努比山羊9只，体重15～20kg，年龄1.5～2.5岁，均属成年山羊，全部为雄性。试验前圈养1周，观察无明显全身疾患，无失牙及咬合紊乱，无关节运动异常者方纳入本实验。随机选取1只山羊作为正常对照组，不做任何处理，饲养1周后处死，取双侧TMJ关节作标本。另外8只山羊作为实验组。

　　1.2 建立TMJOA动物模型 根据胡波，王大章等[2]方法建立，应用1%胶原酶 (Collagenase I type, Sigma U.S.A.) 溶液0.8ml，分别注射入实验组8只山羊双侧TMJ关节上腔，建立实验性TMJOA动物模型。

　　1.3 标本获取 在注射胶原酶后第2、4、12、24周分别随机选取2只山羊，处死后立即行耳屏前角形切口，仔细分离，暴露关节囊，然后切取包括邻接骨组织在内的双侧关节整体标本，经修整后置入10%福尔马林PBS液中固定1周，于混合脱钙液中脱钙2周，沿关节的矢状面分别切取关节的内、中、外1/3三部分组织块，经常规处理、切片。切片厚约5μm。

　　1.4 免疫组织化学染色 山羊TMJ组织常规石蜡包埋后切片。免疫组织化学检测采用EnVision二步法。抗体采用iNOS多克隆抗体NOS2(C-19)(Santa Cruz Biotechnology Inc.)。

　　2 结果

　　2.1 在正常山羊的TMJ标本中，未见有iNOS表达。

　　2.2 在注射胶原酶后2周的4个TMJ标本中，均可见到少量的iNOS表达，主要分布于关节凹表层，滑膜及髁状突未见有表达(图1)。

　　2.3 注射胶原酶后4周的标本表达强烈，关节凹、关节盘、滑膜的表层及髁状突的增殖层，在核膜及胞浆有明显棕黄色颗粒(图2，图3)。

　　2.4 12周标本阳性细胞数多且颜色深染，阳性细胞已出现在髁状突的肥大层及钙化层，在胞膜可见到明显阳性颗粒(图4)。

　　2.5 24周标本阳性细胞数目少于12周标本，但分布更广，仍见有大量阳性细胞集中于髁状突的增殖层。在软骨裂隙两侧的细胞有大量棕黄折光颗粒，提示iNOS与软骨的破坏有关(图5)。

　　3 讨论

　　3.1 NO由NOS以L-精氨酸(L-arginine)和分子氧为底物生成。基于NOS的细胞或组织来源以及表达方式，分为三种亚型：神经元型NOS (neuronal NOS, nNOS); 诱导型NOS(inducible NOS, iNOS); 内皮型NOS(endothelial NOS, eNOS)。人关节软骨细胞、破骨细胞、成纤维细胞以表达iNOS为主，破骨细胞及破骨细胞前体、成骨细胞和骨细胞均既能表达eNOS，又能表达iNOS[3]。这些细胞在致炎细胞因子和(或)细菌脂多糖(LPS)刺激下，均能显著表达iNOS，NO的合成也显著增加[4]。

　　图1 注射胶原酶后2周，iNOS阳性细胞主要分布在关节凹的表层(×100);(略)

　　图2 注射胶原酶4周，iNOS阳性细胞出现在髁状突的增殖层(×400);(略)

　　图3 注射胶原酶后4周，iNOS阳性细胞出现在滑膜表层(×400);(略)

　　图4 注射胶原酶后12周，iNOS阳性颗粒出现在肥大层细胞的胞膜及核内(×400);(略)

　　图5 注射胶原酶后24周，在软骨裂隙两则，软骨破坏处iNOS阳性细胞较多(×200)(略)

　　3.2 Yonekura等[5]证明：类风湿性关节炎和骨关节炎病人血清中的亚硝酸盐(nitrite)含量明显高于正常志愿者，而关节液中的含量明显高于血清。Abramson等[1]研究证明，高浓度NO还抑制软骨细胞合成软骨基质。Takahashi 等[6]研究表明，颞下颌关节紊乱症(TMD)患者关节滑液中 NO水平亦明显高于正常人。Nagai等[7]研究证实，在TMJOA的关节滑液中，NO含量明显高于正常组，说明关节滑液中NO在骨关节病发生和发展中起重要作用。

　　3.3 本研究的结果表明，在正常软骨组织中，iNOS不表达或仅有极微弱的表达。在TMJOA的软骨组织中，iNOS有较强的表达。在病变的早期，iNOS主要集中在髁状突及关节结节软骨的表层，而随着病变的发展，出现在髁状突及关节结节的各层，以增殖层细胞阳性最强。而且，在病变较重的部位，在软骨裂隙边缘的细胞，iNOS阳性细胞数多且表达强烈，提示NO与软骨的破坏有关。在病变的后期，iNOS的表达逐渐变弱，并且变得散在。这与以往的研究结果相符合，TMJOA的病程发展缓慢，且有一定的自限性。随着病程的进展，软骨开始出现一定程度的修复。

　　【参考文献】

　　1 Abramson SB, Attur M, Amin AR, et al. Nitric oxide and inflammatory mediators in the perpetuation of osteoarthritis. Curr Rheumatol Rep, 2001， 3(6):535～541.

　　2 胡波，王大章. 颞下颌关节骨关节病动物模型的建立. 中华口腔医学杂志，1995, 30 (6): 242～246.

　　3 Alderton WK, Cooper CE, Knowles RG. Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition. Biochem J， 2001， 357(Pt 3):593～615. Review.

　　4 Karan A, Karan MA, Vural P, et al. Synovial fluid nitric oxide levels in patients with knee osteoarthritis. Clin Rheumatol， 2003， 22(6):397～399.

　　5 Yonekura Y, Koshiishi I, Yamada K, et al. Association between the expression of inducible nitric oxide synthase by chondrocytes and its nitric oxide-generating activity in adjuvant arthritis in rats. Nitric Oxide， 2003， 8(3):164～169.

　　6 Takahashi T, Homma H, Nagai H, et al. Specific expression of inducible nitric oxide synthase in the synovium of the diseased temporomandibular joint. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod， 2003， 95(2):174～181.

　　7 Nagai H, Kumamoto H, Fukuda M, et al. Inducible nitric oxide synthase and apoptosis-related factors in the synovial tissues of temporomandibular joints with internal derangement and osteoarthritis. J Oral Maxillofac Surg， 2003，61(7):801～807.