槟榔碱诱导血管内皮细胞凋亡Caspase-3活性的研究

　　作者：彭解英　尹晓敏　高义军　方厂云　庞丹琳　夏宇   　作者简介  彭解英(1949~ )，女，湖南人，教授，博士生导师，主要研究方向为口腔黏膜病学研究。

　　［摘要］  目的：初步探讨凋亡“核心蛋白酶”――Caspase-3在槟榔碱(Arecoline)诱导血管内皮细胞（Endothelial Cells, EC）凋亡中的作用。方法：体外培养人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)，将EC与槟榔碱共同培养，应用荧光显微镜观察EC凋亡情况，计算凋亡百分率并用比色法检测Caspase-3的活性。结果：槟榔碱诱导血管内皮细胞组在荧光显微镜下可见到明显的细胞凋亡改变，Caspase-3活性较正常对照组明显增高（P<0.05），且在12 h时最高。结论：槟榔碱可诱导血管内皮细胞凋亡，Caspase-3可能参与了这一细胞凋亡过程的调控。

　　［关键词］  槟榔碱  血管内皮细胞  凋亡  Caspase-3

　　Study on the Caspase-3 Activity in the Arecoline-induced Apoptosis of Endothelial Cells.

　　PENG Jie-ying, YIN Xiao-min, GAO Yi-jun, et al.

　　Department of Stomatologe, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008

　　［Abstract］Objective: The purpose of the study is to investigate the mechanism of the change of caspase-3 activity on the arecoline-induced apoptosis in endothelial cells(EC). Methods: HUVECs were cultured in virto. Apoptosis of HUVECs were induced by arecoline. The changes of apoptotic cells and caspase-3 activity in EC were evaluated with the fluorescecet microscopy and the colorimeteric assay respectively and  were compared with normal control group. Results: Obvious cell apoptotic change could be observed with fluorecent microscopy after arecoline stimulation; The level of caspase-3 activity was significantly higher in the arecoline group than that of normal control group(P<0.01). Conclusion: Arecoline may induce the apoptosis of HUVECs and caspase-3 takes part in the control of apoptotic process.

　　［Key words］  Arecoline  Endothelial cells  Apoptosis  Caspase-3

　　天冬氨酸特异酶切的半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate-specific proteinases,Caspases)家族是哺乳动物细胞中程序性死亡(programmed cell death,PCD)的介导者和执行者，原凋亡信号首先活化不同的Caspase启始因子，再由起始因子激活级联下游的Caspase效应分子，最终由效应分子特异地水解细胞中的一系列底物而导致细胞解体。Caspase-3在Caspase级联反应中处于核心地位，是细胞凋亡发生的关键步骤及一切凋亡信号传导的共同通路。目前认为，Caspase-3活化是细胞即将发生凋亡之前的生化改变［1］，因此，检测Caspase-3活性水平可更为精确的反应细胞凋亡。槟榔碱是否诱导内皮细胞凋亡及Caspase-3活性改变的研究尚未见报道。本研究探讨了槟榔碱诱导内皮细胞的凋亡及可能作用机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  主要试剂和仪器  人脐静脉内皮细胞株(ECV304)由我校细胞培养中心提供，槟榔碱(Sigma公司，美国)，RPMI-1640培养液(Gibco公司，美国)，Hoechst33258(Sigma公司，美国)，Caspase Colorimetric Aassay Kit(R&D公司)。荧光显微镜（日本Olympus公司），低温台式离心机（美国IEC公司），UV-1601紫外分光光度计（日本岛津产）。

　　1.2  人脐静脉内皮细胞培养  人脐静脉内皮细胞系（ECV-304）常规复苏，孵育，传代后，将细胞按1× 106个5 mL/瓶接种于100 mL培养瓶中，培养液为含10%小牛血清的RPMI-1640，于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中孵育24 h用于实验。

　　1.3  实验方法

　　1.3.1  实验设计  正常对照组（n=5）：EC+无血清RPMI-1640培养液；实验组为槟榔碱组（n=5）：EC+含90 μg/mL槟榔碱的无血清RPMI-1640培养液。

　　1.3.2  荧光显微镜检测  于实验用的EC内加入含90 μg/mL槟榔碱的无血清培养液，37 ℃孵育6、12、24、36、48 h后收集细胞。常规细胞涂片，用4%多聚甲醛固定细胞，Hoechst 33258染色，室温染色15 min，荧光显微镜下观察照相。在×10物镜下每个标本随机选取5个视野计数凋亡细胞和总细胞数，计算凋亡百分率。凋亡百分率=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

　　1.3.3  Caspase-3活性测定  根据R&D公司提供的Caspase活性检测试剂盒说明书进行。于实验用的EC内给予含90 μg/mL槟榔碱的无血清培养液，于培养箱中孵育4、8、12、24 h，收集细胞。将处理好的细胞用细胞裂解液（50 μL/1×106 cells）将细胞打散，在冰上裂解10 min，4 ℃离心12 000 g×1 min，取5 μL上清进行蛋白定量，于紫外分光光度计内测定样本在595 nm波长下的吸光度值（OD595）；另45 μL加50 μL ×2反应缓冲液及5 μL Caspase-3反应底物，混匀，37 ℃孵育1 h，分光光度计测定光密度值（OD405），再计算Caspase-3活性：活性=OD405/OD595。

　　1.4  统计学处理  数据用均数±标准差表示，采用SPSS11.0统计分析软件对数据进行t检验。显著性水准=0.05。

　　2  结果

　　2.1  凋亡细胞的形态学改变  荧光显微镜下，见正常细胞核边界规则整齐，染色质均匀分布，凋亡细胞则表现为浓染致密的颗粒、块状荧光。正常培养的HUVECs有少数凋亡，槟榔碱刺激后镜下见荧光标记细胞明显增加，凋亡细胞核固缩，核染色质浓缩，染色质聚集于细胞核周边而使细胞核呈半月形和凋亡小体形成。每个标本镜下随机选取5个视野，分别记数凋亡的细胞数及凋亡百分率，见表1。

　　表1  90 μg/mL槟榔碱诱导EC凋亡的时效效应 略

　　2.2  Caspase活性定量检测结果显示90 μg/mL槟榔碱处理EC 8 h后，Caspase-3开始活化，处理12 h后，Caspase-3的活性明显升高，24 h后有所减少，见表2。

　　表2  90 μg/mL槟榔碱诱导EC凋亡的Caspase-3活性（倍数）值　略

　　3  讨论

　　细胞凋亡是细胞在各种死亡信号刺激后发生的一系列受细胞内源性基因、酶类和信号传导途径调控的一个“瀑布式”激活过程。当细胞得到凋亡前信号后，起始Caspase通过结合特异的辅因子而被激活，然后经一系列有序的依次切割、激活，效应Caspase最终被激活，将其他蛋白酶作为切割底物并引发细胞凋亡。Caspase-3是一种效应分子，在Caspase级联反应中处于核心地位，是细胞凋亡发生的关键步骤及一切凋亡信号传导的共同通路，被称为“死亡蛋白酶”［2］。

　　本实验结果显示：90 μg/mL槟榔碱作用EC后出现了凋亡现象，且以24 h凋亡现象最明显， EC出现了细胞凋亡的典型形态学改变。荧光镜下见细胞核固缩，核染色质浓缩，染色质聚集于细胞核周边而使细胞核呈半月形和凋亡小体形成。发生凋亡的细胞核或胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光，当时间超过48 h时，细胞凋亡数目减少，且出现了坏死现象。槟榔碱处理EC 8 h后，Caspase-3开始活化，处理12 h后，Caspase-3的活性明显升高，24 h后有所减少。提示槟榔碱可诱导 EC凋亡，且 Caspase-3可能参与了槟榔碱诱导 EC凋亡的过程并起着重要作用。

　　槟榔碱作为槟榔的重要成分之一，具有细胞毒性作用。Jeng JH等［3］研究表明槟榔碱能以剂量依赖方式抑制培养的人牙龈成纤维细胞的附着、扩散和迁移，这些抑制效应与细胞内谷胱甘肽(glutathione,GSH)耗损有关。Chang YC等［4］研究亦表明槟榔碱对人颊FB的毒性作用表现在谷胱甘肽转化酶(glutathiones-transferases,GST)活性降低，GSH含量减少。槟榔碱作用EC后，可能由于细胞内GSH耗损，活性氧的产生和消除之间的平衡被破坏，破坏膜磷脂及膜的流动性、完整性，使生物膜如细胞膜、线粒体膜结构和功能丧失，线粒体膜断裂，释放细胞色素C（cytochrome C,Cyto-C)。过量的Cyto-C则可激活Caspase，死亡蛋白酶-Caspase-3的活化可使多种作为细胞骨架的底物蛋白发生裂解，导致细胞从所黏附的基质上脱落和细胞形态异常而出现凋亡改变。Dimmeler等［5］证实在OXLDL诱导EC凋亡的过程中有Caspase-3酶活性的增高，Farber等［6］也发现Caspase-3的抑制剂能抑制OXLDL引起的EC凋亡。本实验结果测得Caspase-3酶活性在12 h最大，形态学改变在24h 最明显，其时间差异进一步说明Caspase-3在槟榔碱诱导EC凋亡过程中起关键作用，因此，我们推测Caspase-3可能是槟榔碱诱导EC凋亡的执行者之一。

　　口腔黏膜下纤维性变(oral submucous fibrosis,OSF)是一种慢性、隐匿性、具有癌变可能的疾病［7］，目前认为OSF与咀嚼槟榔关系密切［8］。槟榔碱作为槟榔的重要成分之一，具有细胞毒性作用，我们推测，咀嚼槟榔后可引起口腔黏膜微创伤、溃疡促进槟榔成分中的细胞毒性和基因毒性扩散，这些毒性进入微循环中，与EC接触，诱导EC凋亡，凋亡的EC会释放出ET-1和血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor,PDGF）等，这些细胞因子一方面刺激平滑肌细胞增殖，使血管壁增厚，官腔狭窄，组织缺氧；另一方面，这些细胞因子作用于周围的成纤维细胞(fibroblast,FB)，使FB增殖，产生更多的胶原纤维堆积于黏膜下层，导致OSF的发生。当然，凋亡的EC对细胞因子分泌的影响有待进一步的探讨。

　　参考文献

　　［1］  Cohen GM. Caspases: the executioners of  apoptosis ［J］. Biochem J, 1997, 326∶1-16

　　［2］  Jacobson MD, Weil M, Raff MC. Programmed cell death in animal development ［J］. Cell, 1997,88(3)∶347-354

　　［3］  Jeng JH, Lan WH, Hahn LJ,et al. Inhibition of the migration, attachment, spreading, growth and collagen synthesis of human gingival fibroblasts by arecoline, a major areca alkaloid, in vitro ［J］. J Oral Pathol Med, 1996,25(7)∶371-375

　　［4］  Chang YC, Hu CC, Tseng TH, et al. Synergistic effects of nicotine on arecoline-induced cytotoxicity in human buccal mucosal fibroblasts ［J］. J Oral Pathol Med, 2001 ,30(8)∶458-464

　　［5］  Dimmeler S, Haendeler J, Galle J,et al. Oxidized low-density lipoprotein induces apoptosis of human endothelial cells by activation of CPP32-like proteases. A mechanistic clue to the 'response to injury'  hypothesis ［J］. Circulation,1997 ,95(7)∶1 760-1 763

　　［6］  Farber A, Kitzmiller T,Morganelli PM,et al. A caspase inhibitor decreases oxidized low-density lipoprotein-induced apoptosis in bovine endothelial cells ［J］. J Surg Res, 1999, 85(2)∶323-330

　　［7］  Pillai R, Reffiar KS. Pathogenenesis of oral submucous fibrosis-relatinship to risk factors associated with oral cancer ［J］. Cancer, 1992, 69(8)∶2 011-2 020

　　［8］  翦新春，刘蜀凡，沈子华，等.口腔黏膜下纤维性变的临床研究［J］.中华口腔医学杂志,1989,24(5)∶299-301

　　基金项目  湖南省科技厅发展基金资助（编号：02SSY3052）