微透析技术及其在口腔医学领域中的应用

作者：王琳综述 廖贵清审校    作者单位：中山大学光华口腔医学院·附属口腔医院口腔颌面外科 广东 广州 510055 　　【摘要】  微透析技术是近年发展起来的一种活体细胞外液生化物质采样分析技术，被广泛应用于生物医学领域。本文主要介绍微透析技术的原理、特点和检测物质，以及在口腔医学领域的应用。

　　【关键词】  微透析技术； 细胞因子； 氨基酸类神经递质

　　Microdialysis and its application in stomatology  WANG Lin, LIAO Gui-qing. （Dept. of Oral and Maxillofa-cial Surgery, Guanghua College of Stomatology, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510055, China）

　　[Abstract]  Microdialysis technique, developed recently, is a method used to obtain biochemical samples from the extracellular fluid of live tissues. It has been performed widely in biomedical field. The principles, features, samples of microdialysis and its application in stomatology were introduced in this review. 

　　[Key words]  microdialysis technique； cytokine； amino neurotransmitter

　　微透析技术（microdialysis）是近年发展起来的一种活体细胞外液生化物质采样分析技术。它具有在体、原位取样、实时、在线检测等特点，已被广泛应用于生物医学领域，包括生物化学检测和药物代谢的研究，并尝试应用于局部治疗性给药。

　　1  微透析技术的原理和特点

　　1.1  微透析技术的原理微透析技术是以透析原理为基础的在体取样技术[1]。通过在组织内埋置微透析探针，利用从探针流出的透析液中待测化合物浓度低于在探针膜周围组织基质中浓度时，组织中待测化合物会沿浓度梯度逆向扩散进入透析液，从活体组织连续取样。

　　1.2  微透析技术与现代分析技术联用

　　由于微透析技术获得的样品量非常有限，一般只有1~10 μL，而且透析过程也不可避免地会稀释样品，故待测物浓度很低。因为微透析技术的这一特点，因此要求分析方法灵敏度高、样品量需求少、分析速度快。如基于非分离的方法可用来在某一时间点对某一物质进行测定，包括生物传感器[2]、免疫测定、质谱等，每次只能监测1种化合物。而基于分离的方法每次能监测多种化合物，可在线检测多种物质，包括高效液相色谱法、高效毛细管电泳法，检测手段有免疫、紫外吸收、荧光检测、激光诱导荧光检测、电化学和质谱等[3]。

　　1.3  回收率的校正

　　微透析取样是在非平衡条件下进行的，测得透析液中化合物浓度只是探针周围样品基质中实际浓度的一部分，必须用体内相对回收率[4]来修正测量值。其方法是先测定透析管内透析物的浓度和组织间隙中透析物浓度的比值，再根据这一比值推测组织中的浓度。然而由于生理病理进程的变化，回收率也是处于波动变化中，因此必须定期测定修正回收率。

　　1.4  其他

　　微透析技术需要埋置探针是侵袭性技术，会对组织局部造成损伤，因此从理论上讲，微透析技术对某些与损伤修复有关的化学物质的采样分析会产生较大偏差如对活性氧等的检测。此外，微透析液中测得的化合物往往无法判别其细胞来源，如骨骼肌细胞外液的成分往往受到多种细胞类型如内皮细胞、白细胞、成纤维细胞以及骨骼肌细胞分泌活动的影响。

　　2  微透析技术检测的应用

　　待测物质沿着浓度梯度通过半渗透中空透析膜，由各种聚合材料制作的微透析膜可以筛选出相对分子质量为0.5×104~10×104的化学物质。

　　2.1  微透析技术用于能量代谢分析

　　微透析联用乳酸盐传感器能够实时监测组织中乳酸盐的含量[5]；基于安培计的生物感受器可以用于测定乳酸盐和葡萄糖浓度[6]。微透析技术分析细胞外液中的活性氧始于20世纪90年代初，后来又用来进行笑气释放的测定、脂基以及羟自由基的活性测定[7]。

　　2.2  微透析技术用于神经科学的研究

　　免疫测定法和微透析技术联用可测定一些不同的多肽，包括神经肽、P物质和乙酰胆碱[8]。Lehner等[9]用微透析技术与高效液相色谱相连，测定大鼠脑内的5-羟色胺。

　　2.3  微透析技术用于细胞因子的研究

　　细胞外液中细胞因子的微透析取样比较困难。一方面由于其相对分子质量较大，另一方面是由于其回收率很低。目前，已有商品化相对分子质量为10×104的透析膜可以用于细胞因子的取样，还有用相对分子质量为30×105的透析膜从受伤的人脑进行白细胞介素（interleukin，IL）-β，IL-6和神经生长因子的活体取样，测量脑组织细胞外液腔隙的细胞因子水平，以及采用相对分子质量为30×105的透析膜在体收集肿瘤生长因子（tumor growth factor，TGF）-β1的研究。为了探讨某一细胞因子调节其他种类细胞因子的释放，可以利用微透析技术的双向性将特定的细胞因子如血管内皮（细胞）生长因子（vessel endothelium growth factor，VEGF），依靠渗透泵输送到体内特定局部，干扰局部网络，并用微透析技术收集可能受VEGF调节的其他细胞因子，进行取样测试，研究组织的改建。为了提高细胞因子微透析取样的相对回收率，Ao等[10]利用细胞因子抗原和固定在聚合珠的抗体结合提高弥散运输的驱动力，可将回收效率提高3~20倍。此外他们还尝试采用标准蛋白偶联化学技术将肝素或牛血清白蛋白-肝素共聚物固定在碳酸化的微球上，提高细胞外液肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α的回收效率。

　　3  微透析技术在口腔医学的应用

　　目前，微透析技术虽然在一些学科中应用比较广泛，但在口腔颌面研究领域的应用多集中在关于口腔颌面部关节肌肉疼痛产生的机制研究。

　　3.1  微透析技术检测神经肽和炎性介质

　　Hedenberg-Magnusson等[11]运用微透析技术检测了咬肌疼痛患者局部注射糖皮质激素对前列腺素E-2和白三烯β-1水平的影响，以及前列腺素E-2和白三烯β-1的水平变化与局部疼痛或痛觉过敏的关系。结果显示，糖皮质激素的局部注射并未引起咬肌内前列腺素E-2水平的明显改变；肌筋膜痛患者咬肌休息时疼痛减轻、最大自主张口度时疼痛增加，这与咬肌内前列腺素E-2水平降低有关；此外，肌筋膜痛患者和咬肌局部疼痛患者咬肌内白三烯β-1含量均明显升高。

　　由于神经肽（neuropeptide，NP）Y分子的黏附特性，利用微透析技术进行神经肽Y测定较为困难。Ernberg等[12]选择了10名健康志愿者，分别选用了3种不同类型的微透析探针置入咬肌和斜方肌，采取几种不同类型的灌注液以不同的灌流速度进行神经肽Y的微透析取样，证实了对人体肌肉进行微透析取样检测神经肽Y含量是可行的；同时还发现，在灌注液中加入适量的血清白蛋白有利于提高神经肽Y的相对回收率。此后，他们还研究了等长收缩对肌肉内部神经肽Y含量的影响以及与局部疼痛发展的关系，认为神经肽Y水平与疼痛发展没有明显关系[13]。

　　3.2  微透析技术检测氨基酸类递质

　　Cairns等[14]为了研究谷氨酸诱导的咬肌局部机械性敏感刺激增强是否涉及到外周N-甲基-D-天（门）冬氨酸受体的激活，将18个健康男性志愿者随机分为2组，进行两个阶段的谷氨酸注射。首先均在2组志愿者的右侧咬肌局部注射一定量的谷氨酸，30 min后一组志愿者注射谷氨酸，另一组志愿者注射谷氨酸加氯胺酮。首次注射前，对右侧咬肌注射点、注射点2 cm以上部位、右侧颞肌和左侧咬肌等4个部位进行了压痛阈评价，然后分别在2次注射10~30 min这段时间里，每隔5 min重复上述评价，最后在2次注射结束60 min后再记录压痛阈。结果发现，谷氨酸诱导的肌肉疼痛程度和区域大小都由于氯胺酮的使用而明显下降。提示了谷氨酸诱导的机械敏感性增加部分是通过外周N-甲基-D-天（门）冬氨酸受体激活实现的。他们又将食物添加剂味素静脉注射到大鼠体内，用谷氨酸选择性生物传感器结合微透析取样技术，观察咬肌内谷氨酸的浓度。结果证实，全身应用味素能引起局部组织内谷氨酸浓度的增加，引起咬肌感觉传入纤维发放冲动，迅速降低机械刺激阈值，静脉注射氯胺酮则可阻止味素的这种作用。从而说明组织间隙谷氨酸浓度升高会改变人骨骼肌对疼痛的敏感性[15]。Bereiter等[16]在巴比妥全麻的雄性大鼠、未处理的雌性大鼠和去卵巢雌性大鼠的颞下颌关节（temporomandibular joint，TMJ）区域注入芥末油之后，采用微透析取样技术测量三叉神经亚核/上段颈髓结合区各类氨基酸类神经递质的含量。发现雄性大鼠在颞下颌关节区域注入芥末油5 min后出现谷氨酸、天冬氨酸和丝氨酸的升高，并在40~45 min后出现再次升高；而正常雌性鼠或给予低剂量雌激素补充的切卵巢大鼠，在颞下颌关节区域注入芥末油后5 min出现以上递质增加，但未见40 min后再次升高的现象；给予大剂量雌激素补充的切卵巢大鼠则未见上述增加。雄性大鼠和普通雌性鼠在颞下颌关节区域注入芥末油处理20 min后表现出甘氨酸增加，而去卵巢雌性大鼠的甘氨酸未见到增加。通过微透析探针灌注高浓度钾可以导致各受试组出现谷氨酸、天冬氨酸和甘氨酸含量的增加。而另一实验中，往微透析探针灌注谷氨酸-天冬氨酸再摄取抑制剂可以导致谷氨酸迅速增加，但是在大剂量使用雌激素组比低剂量雌激素组和雄性大鼠组表现得更为明显。说明性激素可部分通过调节谷氨酸类的再摄取而影响三叉神经亚核/上段颈髓结合区域谷氨酸类神经传递；在三叉神经亚核/上段颈髓结合域不同的氨基酸类递质释放可能与从颞下颌关节区域不同的感觉输入不同有关。

　　4  结束语

　　微透析技术作为一种优良的活体取样方法，在口腔医学的应用仍有待扩展, 如阐明有些口腔颌面疾病的发生机制，连续动态反映颌骨修复重建涉及的生理生化改变，提高口腔颌面肿瘤治疗效果等。值得注意的是，微透析只能从分子水平上检测细胞间隙的化学物质，并不能反映细胞内的化学组成和组织的结构改变，必须把微透析和其他的研究检测手段相结合，才能更好地利用其为基础研究和临床治疗服务。

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