报告基因及其在牙发育和牙再生研究中的应用

作者：王劲茗综述 凌均 审校    作者单位：中山大学光华口腔医学院·附属口腔医院牙体牙髓病科 广东 广州 510055 【摘要】  报告基因可通过基因产物的表达来“报告”目的基因的表达调控，是细胞和组织内监测基因表达与蛋白定位的理想标记。报告基因种类多样，可根据不同需要选择应用。报告基因广泛用于牙发育及牙再生机制的研究，包括研究基因表达和调控、作为基因转染对照、细胞分化和定位的示踪等。为揭示牙发育的启动、细胞分化和形态调控各阶段的分子机制，探索牙组织工程与牙再生的有效方法提供了较好的研究平台。

【关键词】  报告基因； 牙发育； 牙再生

Reporter gene and its application in tooth development and tooth regeneration  WANG Jin-ming, LINGJun-qi. （Dept. of Conservative Dentistry and Endodontics, Guanghua College of Stomatology, Sun Yat-Sen University,Guangzhou 510055, China）

    [Abstract]  Reporter gene whose expression is easily detectable and therefore is used to report the expression and regulation of target gene. A multiplicity of reporter genes can be applied to diverse fields according to different purpose. As an effective technology, reporter gene has been used extensively in the studies of tooth development and tooth regeneration. It was helpful in studying the regulation and expression of genes, controlling study of transfection, as well as differentiation and orientation of cells. And it becomes a valuable tool in studies of mocular basis in tooth development which will provide foundamental knowledge to regeneration of tooth.

    [Key words]  reporter gene； tooth development； tooth regeneration

    报告基因（reporter gene）是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，是表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列与目的基因融合表达后，可通过报告基因产物的表达来“报告”目的基因的表达调控。作为细胞组织内监测基因表达和蛋白定位的理想标记，报告基因必备的条件是全序列已被测定，其表达产物能定量检测，在被转染细胞中无相似的内源性表达。报告基因种类很多，应用广泛[1]。本文将对其分类、选择以及在牙发育和再生研究中的应用作一综述。

    1  报告基因的分类和特点

    1．1  氯霉素转乙酰酶

    氯霉素转乙酰酶（chlormnphenicol acetyltran-sferase，CAT）是应用最早的报告基因系统，是大肠杆菌蛋白合成酶的抑制剂，能将乙酰基从乙酰辅酶A转移到放射性标记的氯霉素上[2]。这种酶性质稳定，但线性范围和灵敏性逊于其他报告基因。目前常用液闪记数法、薄层层析法和酶联免疫分析法进行测定。

    1．2  β-半乳糖苷酶

    β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，LacZ）是一种大肠杆菌的细菌酶，由lacZ基因编码，使用β-半乳糖苷作底物。能水解半乳糖苷或乳糖，利用水解后产生的有色物质作定量分析[3]。用分光光度法、荧光法或化学发光法可快速直接地在细胞提取物中检测，被广泛用于原位组化分析。

    1.3  β-葡萄糖苷酸酶

    β-葡萄糖苷酸酶（β-glucuronidase，GUS）是大肠杆菌的一种水解酶，能水解葡萄糖苷酸[4]。主要用于缺乏该酶的植物病原体、植物、酵母及真菌的转基因研究，在医学研究中相对应用较少。

    1．4  分泌型碱性磷酸酶

    分泌型碱性磷酸酶（secreted alkaline phos-phatase，SEAP）是人胎盘碱性磷酸酶的突变体，最大特点是能由表达细胞分泌到细胞外，检测时可在不破坏细胞的情况下，任意时间点取细胞培养上清液进行重复、动态的检测，且被检测细胞还可继续其他用途。因此，SEAP具有很好的应用前景[5]。

    1．5  荧光素酶

    荧光素酶（luciferase，Luc）是能催化荧光素或脂肪醛，并使其氧化发光的一类酶的总称[6]。可来源于细菌、萤火虫、海星、海肾、发光鱼和发光甲虫。特点为分析快速、灵敏度高（比CAT高100倍）、线性范围广和半衰期短，适用于基因表达物诱导效应的瞬间分析。常用的检测Luc的方法有液闪法和光照度计法。

    1．6  绿色荧光蛋白

    绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是从水母体内克隆出的一种荧光蛋白[7]，经紫外光和蓝光激发无需辅助因子及底物即可自动发射绿色荧光，可用荧光显微镜或流式细胞仪检测，通过荧光强弱反映表达产物的表达量。它具有分子小、荧光稳定、检测方便及对活细胞无伤害等优点，被称为“活细胞的分子探针”。有的GFP突变体还可以发蓝光或黄光[8]。

    1．7  红色荧光蛋白

    红色荧光蛋白（red fluorescent protein，RFP）来源于珊瑚虫和海葵，在紫外光照射下发射红色荧光，是GFP一种很好的代替和补充，可实现细胞内多荧光标记。Terskikh等[9]培养出的“荧光计时器蛋白”，是RFP的一个变种，可在一定时间内完成鲜绿色—黄色—橙色—红色的颜色转变。

    2  报告基因的选择

    报告基因的选择应根据研究目的、组织与细胞的类别、信号检测的时间性与空间性，以及首选的检测方法来决定，此外还要考虑报告基因的稳定性与灵敏度、线性范围及半衰期。例如萤火虫Luc和海肾Luc对蛋白质水解较敏感，半衰期短，适合于转染效率和动力学研究；野生型GFP与Luc相比较，荧光信号的线性范围较窄、灵敏性较差，不太适合转录的定量研究。目前许多常用的报告基因已开始联合使用，将这两种报告基因的优点联合起来，形成双报告基因分析系统，如SEAP与Luc或LacZ联用以标化转染效率；LacZ与海肾Luc或萤火虫Luc结合，可两次检测基因的转录过程；还可将Luc与CAT和（或）GUS结合形成双报告甚至多报告基因系统，使检测结果更精确，稳定性更好。

    3  报告基因在牙发育和再生中的应用

    牙齿的生长发育和哺乳动物其他器官一样，包含一系列复杂而精巧的调控过程，包括对牙齿位置、形态及数量的调控。很多生物分子组成的复杂信号网络参与其中，目前已发现多达300种基因在牙齿生长发育中表达。这些信号分子和转录因子在牙发育的不同时空重复出现产生不同作用[10]。报告基因技术的发展为牙发育及其再生的机制研究提供了多种途径。

    3．1  基因调控和表达的研究

    基因调控机制是研究牙发育时期基因功能的重点和难点，因为基因表达产物非常复杂难以对其定量和定性，要在细胞的生长周期的任意点了解细胞的基因表达产物更加困难。报告基因分析系统为牙发育中基因调控和表达的研究带来了新希望。目前，很多实验室已成功建立了由各种启动子激发的携带报告基因的转基因小鼠模型。Braut等[11]用Col1a1-2.3-GFP转基因小鼠研究成牙本质细胞和成骨细胞的分化，发现GFP在成牙本质细胞中的表达与牙本质涎磷蛋白（dentin sialo-phosphoproteins，DSPP）相关，在成骨细胞中的表达则与牙本质基质蛋白-1（dentin matrix protein-1，DMP-1）相关，证明此2.3 kb的Col1a1启动子片段对成牙本质细胞及成骨细胞的分化起重要作用。Sreenath等[12]用转染了LacZ的ROSA26转基因小鼠与Dspp-Cre转基因小鼠交配获得纯合子来研究dspp基因功能，并用于检测Cre重组酶的活性。

    将各种报告基因插入到不同类型细胞中，使它处在某个与牙发育相关基因启动子控制之下，通过激活启动子，检测报告基因表达产物，可使研究者更方便、快速地了解到基因转录的适时信息。Chen等[13]构建了2.7 kb大鼠骨涎蛋白（bonesialoproteins，BSP）基因启动子驱动的Luc报告基因系统来研究BSP在大鼠釉质发生中的表达与作用，结果在釉上皮、成釉细胞及牙胚发育的各阶段均检测到不同程度Luc荧光信号，提示bsp基因参与调控牙釉质形成及矿化。Chen等[14]用Luc标记dmp-1基因在不同组织细胞中的表达，通过对Luc荧光强度的分析发现，dmp-1基因在成骨细胞及牙髓细胞中的表达量是在肝细胞和海拉细胞（子宫颈癌组织细胞株）中表达量的5～7倍。

    Alappat等[15]用CAT标记与牙发育相关的编码核蛋白基因pigpen，发现其N末端为转录活性区。为研究釉原蛋白（amelogenin proteins，AMG）基因调控，Adeleke-Stainback等[16]先用LacZ转基因鼠确定该基因1号外显子上游3.5 kb片段的功能，再用以病毒为载体的CAT报告基因标记另外两个1.9 kb和1.5 kb小片段，发现这些片段均为重要的基因功能区。

    3．2  基因转染对照研究

    报告基因作为基因转染对照研究的作用主要是校正转染效率。Jin等[17]用腺病毒载体构建携带gfp基因及骨形态发生蛋白-7（bone morphogeneticprotein-7，BMP-7）基因的重组腺病毒，研究基因治疗在牙周组织再生中的作用。他们发现，将转染了bmp-7基因的成纤维细胞植入骨缺损处，可以促进软骨形成、骨化以及牙骨质形成。之后为了研究bmp-7和头蛋白基因在牙本质发生中的作用，他们分别用gfp、bmp-7和头蛋白基因转染大鼠成纤维细胞并进行对比，证明头蛋白基因可抑制成牙骨质细胞矿化[18]。

    3.3  细胞分化研究

    利用干细胞进行牙再生或牙体组织再生是目前的研究热点，报告基因可以示踪干细胞的诱导分化过程。Hu等[19]利用gfp转基因小鼠示踪骨髓干细胞的分化，他们将gfp转基因小鼠的骨髓干细胞与野生型小鼠的牙胚上皮和牙胚间充质共培养，结果在部分已分化的细胞中检测到绿色荧光，证实骨髓干细胞可分化为成釉细胞样及成牙本质细胞样细胞。Mina等[20]利用pOBCol3.6gfp转基因鼠来标识牙髓干细胞分化为成牙本质细胞及成骨细胞。最近，Yamazaki等[21]将胚胎13.5 d的Rosa26R转基因小鼠的牙胚间充质细胞成功诱导向软骨样及骨样细胞分化，并利用流式细胞仪和LacZ荧光显示系统对活细胞进行检测。

    3．4  细胞定位研究

    报告基因的显像性使它成为细胞定位尤其是活细胞示踪的重要工具。Kim等[22]将LacZ转基因小鼠的第一磨牙移植到野生型小鼠的相应牙槽窝内，移植成活后通过LacZ显色观察到牙周膜细胞不显色，而牙髓细胞部分显色，说明供体的牙周组织完全被宿主新生的组织代替，而供体的牙髓细胞部分成活。Cho等[23]将野生型小鼠的牙胚移植入LacZ转基因小鼠肾囊膜内，两周后发现部分表达LacZ的细胞及大量红细胞侵入牙胚且定植于未来牙髓的部位，这是牙胚发育过程中细胞迁移路径可视化的一种尝试。

【参考文献】  [1] Naylor LH. Biochem Pharmacol, 1999, 58（5）：749-757.

[2] Lewis JC, Feltus A, Ensor CM, et al. Anal Chem, 1998, 70（17）：579-585.

[3] Lim K, Chae CB. Biotechniques, 1989, 7（6）：576-579.

[4] Zezulak M, Snyder JJ, Needleman SB. J Forensic Sci,1993, 38（6）：1275-1285.

[5] Wang M, Orsini C, Casanova D, et al. Gene, 2001, 279（1）：99-108.

[6] Leclerc GM, Boockfor FR, Faught WJ, et al. Biotechni-ques, 2000, 29（3）：594-596.

[7] Prasher DC, Eckenrode VK, Ward WW, et al. Gene, 1992, 111（2）：229-233.

[8] Tavare JM, Fletcher LM, Welsh GI. J Endocrinol, 2001, 170（2）：297-306.

[9] Terskikh A, Fradkov A, Ermakova G, et al. Science, 2000, 290（5496）：1585-1588.

[10] Zhang YD, Chen Z, Song YQ, et al. Cell Research, 2005, 15（5）：301-316.

[11] Braut A, Kollar EJ, Mina M. Int J Dev Biol, 2003, 47（4）：281-292.

[12] Sreenath TL, Cho A, Thyagarajan T, et al. Genesis, 2003, 35（2）：94-99.

[13] Chen J, Sasaguri K, Sodek J, et al. Eur J Oral Sci, 1998, 106（Suppl 1）：331-336.

[14] Chen S, Inozentseva-Clayton N, Dong J, et al. J Cell Biochem, 2004, 92（2）：332-349.

[15] Alappat SR, Zhang M, Zhao X, et al. Dev Dyn, 2003, 228（1）：59-71.

[16] Adeleke-Stainback P, Chen E, Collier P, et al. Connect Tissue Res, 1995, 32（1/4）：115-118.

[17] Jin QM, Anusaksathien O, Webb SA, et al. J Periodontol, 2003, 74（2）：202-213.

[18] Jin QM, Zhao M, Economides AN, et al. Connect Tissue Res, 2004, 45（1）：50-59.

[19] Hu B, Unda F, Bopp-Kuchler S, et al. J Dent Res, 2006, 85（5）：416-421.

[20] Mina M, Braut A. Cells Tissues Organs, 2004, 176（1/3）：120-133.

[21] Yamazaki H, Tsuneto M, Yoshino M, et al. Stem Cells,2007, 25（1）：78-87.

[22] Kim E, Cho SW, Yang JY, et al. Oral Dis, 2006, 12（4）：395-401.

[23] Cho SW, Hwang HJ, Kim JY, et al. J Electron Microsc （Tokyo）, 2003, 52（6）：567-571.