牙本质基质蛋白-1与生物矿化

作者：刘冬梅综述 董福生审校    作者单位：1．河北医科大学口腔医院儿童牙病科；2.口腔颌面外科 河北 石家庄 050017     【摘要】  牙本质基质蛋白（DMP）-1是骨、软骨、釉质、牙骨质和牙本质生物矿化所必需的一种酸性非胶原蛋白。蛋白质化学研究显示，DMP-1全基因序列是生物矿化的启动因子，由C末端和N末端组成。体内实验证实DMP-1具有多方面功能，不仅是生物矿化的信号分子，同时也是调节因子，对成骨细胞和成牙本质细胞的成熟至关重要。本文就DMP-1在基因调节、组织细胞中的表达以及成骨、成牙本质中的生物矿化作用作一综述。

    【关键词】  牙本质基质蛋白-1； 生物矿化； 成骨； 成牙本质

    Dentin matrix protein-1 and biomineralization  LIU Dong-mei1, DONG Fu-sheng2. （1. Dept. of Pediatric Den-tistry, College of Stomatology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China; 2. Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery, College of Stomatology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China）

    [Abstract]  Dentin matrix protein（DMP）-1 is an acidic non-collagenous protein that is necessary for the properbiomineralization of bone, cartilage, cementum, dentin and enamel. Protein chemistry studies have shown that the full length of DMP-1, as a precursor, is cleaved into two distinct forms: the C-terminal and N-terminal fragments. DMP-1 is believed to have multiple functions in vivo, acting both as a signaling molecule and a regulator of biomineralization and is essential in the maturation of odontoblasts and osteoblasts. This article reviewed the role of DMP-1 in gene regulation, tissue/cell expression patterns, and biominerealized functions in dentinogenesis and osteogenesis.

    [Key words]  dentin matrix protein-1； biomineralization； dentinogenesis； osteogenesis

    骨和牙本质形成是一个生物矿化过程，是由基质介导和一系列调节因子参与完成的生理过程。在骨、牙本质形成过程中，成骨细胞和成牙本质细胞分别分泌富含Ⅰ型胶原的非矿化基质，形成类骨质和前期牙本质。除Ⅰ型胶原，骨与牙本质的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）中包含的大量非胶原蛋白（non-collagenous protein，NCP），起到促进和调节胶原纤维与晶体矿化的作用。牙本质基质蛋白（dentin matrix protein，DMP）-1是矿化组织中非胶原蛋白的重要组成部分，是在大鼠cDNA文库中检测到的酸性磷酸化细胞外基质蛋白。最近的研究表明，DMP-1在成牙本质细胞、成牙骨质细胞、成釉细胞、成骨细胞、骨细胞前体细胞、骨细胞以及某些非矿化组织中均有表达[1-2]。以DMP-1氨基酸组成为基础，学者们推测DMP-1在牙本质、骨基质等细胞外基质生物矿化中具有重要的晶核形成作用，对启动矿化结晶，维持矿化组织结构起着重要作用，因此是重要的生物矿化特异性基质蛋白。

    1  牙本质基质蛋白-1的基因结构特点

    DMP-1是由George等[3]在1993年应用多抗筛选SD大鼠成牙本质细胞-牙髓成纤维细胞复合体文库时发现的一种新酸性牙本质基质蛋白，并命名为AG1。之后又发现AG1基因定位于小鼠染色体5q21，且与成纤维细胞生长因子5紧密相连，于是按染色体的命名规则将AG1称为DMP-1。目前，人类已成功克隆了大鼠[4]、小鼠[5]、牛[6]、鸟[7]、鳄[8]、蝙蝠[9]和猪[10]等多种动物以及人的dmp-1基因全序列。人的dmp-1基因定位于染色体4q21上，其蛋白是由6个外显子构成的1.539×103的单一开放阅读框编码的513个氨基酸残基，主要的3种氨基酸为丝氨酸（21.4%）、谷氨酸（15.6%）和天门冬氨酸（12.1%）。大鼠dmp-1cDNA全长为1.3×104 bp，由6个外显子和5个内含子构成，外显子1包括5′非翻译区；外显子2编码18个氨基酸，其中包括16个氨基酸的信号肽；外显子3~5分别编码16、11和15个氨基酸；外显子6编码精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽（Arg-Gly-Asp，RGD）序列、终止子和1.1×103 bp的3′非编码区。

    牛dmp-1基因包含1.530×103 bp构成的一个开放阅读框，编码510个氨基酸，另外还有5′端92 bp的非编码区，3′端1.379×103 bp的非编码区，还包括一个多聚腺苷酸化信号和Poly（A+）尾；编码蛋白等电点为3.95，相对分子质量为5.56×104。dmp-1编码的6个外显子有以下几点共同特征：1）前5个外显子相对较小，为33~104 bp不等。第6个外显子最大，包含了80%的编码信息。2）第2个外显子编码信号肽氨基酸。3）第5个外显子由多个片断接合而成。4）第1个内含子最大，为（3.791~6）×103 bp，对dmp-1在组织中的特异性表达起到重要作用[11-12]。第4个内含子最小，为162~189 bp。在同源性方面，大鼠、小鼠、牛、猪与人dmp-1基因序列的同一性分别为66.2%、70.5%、66.1%和67.0%。激活蛋白-1（activating protein-I，AP-1）、转录因子Runx2（runt-related transcription factor 2，Runx2）和结合蛋白增强因子（CCAAT/enhancerbinding proteinα，C/EBP）是骨和牙组织特异性调节转录因子[13-14]，这些转录因子的电位反应元素存在于dmp-1的启动因子中[15-16]，其中AP-1在成骨细胞分化早期的dmp-1转录子中表达，但在成骨细胞分化晚期未见表达。

    dmp-1基因有一些高度保守区，如16个氨基酸残基构成的疏水性信号肽和细胞黏附RGD三肽等。另外，DMP-1在牙本质中含量极少，只有高度磷酸化的DMP-1才能与其他磷酸化蛋白一起作为调节分子进入预先形成的结构基质中，通过与结构基质特异位点结合启动矿化晶体的成核作用，并进一步调节晶体的生长、形态以及基质矿化最终形成的大小[17-18]。

    2  牙本质基质蛋白-1在组织和细胞中的表达

    DMP-1最初是从大鼠牙本质中分离出来，最近的许多研究表明，DMP-1在骨组织中的表达水平远高于牙本质中的表达[19-21]。同时DMP-1还可表达于许多非矿化组织中，如脑、涎腺和某些上皮来源的肿瘤中[22-25]。

    在牙齿中，DMP-1可以表达于牙髓细胞、成牙本质细胞、前期牙本质、牙本质和牙骨质中。牙本质中主要分布于管周牙本质，牙骨质中主要表达于牙骨质细胞及其周围基质中[1，26]。此外在釉质矿化期，成釉细胞的细胞质内亦表达DMP-1，待矿化形成后分泌性牙本质细胞和成釉细胞中则无DMP-1表达[27]。

    DMP-1在骨组织中的表达具有时空特异性，对小鼠胚胎期至出生后8周DMP-1的研究表明，DMP-1早期出现在软骨细胞和成骨细胞内，出生后则主要由骨细胞表达[22]。通过检测鸡（不能形成牙的动物模型）和鼠（能形成牙的动物模型）的骨组织，结果发现，DMP-1信使RNA表达于骨细胞和前骨细胞，但不表达于成骨细胞。骨细胞形成后，DMP-1出现在骨细胞的细胞外骨基质和骨

    细胞突起中[28]。核心结合因子-1（core binding fac-tor-α1，Cbf-α1）和DMP-1在软骨和骨中重叠表达，但Cbf-α1表达早于DMP-1。对Cbf-α1-/-型小鼠DMP-1表达的检测显示，Cbf-α1缺陷型小鼠的骨发育中未见DMP-1表达[20]。以上的结果证明，dmp-1是早期骨形成过程中软骨细胞和成骨细胞以及骨形成后骨细胞的标记基因，同时也提示DMP-1可能是骨发育过程中Cbf-α1的一个重要靶分子。

    在软组织中，DMP-1广泛分布于大脑、脑干的脑脊髓灰质中，并确定其表达于大锥体细胞、浦肯野细胞、室管膜细胞，管膜下细胞和脉络丛的细胞表面，DMP-1在胰腺中表达于朗格汉斯岛，肾脏中表达于远端小管、汉勒袢的上皮[2，23]，在唾液腺和汗腺中，DMP-1存在于导管细胞中，并且与基质金属蛋白酶（matrix metalloproteina-metalloproteinase，MMP）-9结合表达[24，29]。DMP-1还表达于乳腺、结肠、肺和口腔癌组织中[30-31]。在肺癌和口腔癌中，DMP-1和MMP-9联合表达。DMP-1还具有通过结合MMP-9和CD44从而促进结肠癌细胞侵入的功能[31-32]。

    3  牙本质基质蛋白-1的生物功能

    3．1  牙本质基质蛋白-1诱导细胞分化并促进矿化结节形成

    dmp-1基因所在区域包含有与牙本质磷蛋白和骨磷蛋白相关的超家族基因位点，可推断DMP-1在牙本质和骨的生物矿化过程中具有潜在重要性。许多基因转染实验证实了DMP-1在生物矿化中的作用：通过建立稳定的转基因细胞系过表达DMP-1的腺病毒感染细胞，在多潜能细胞和间充质源性细胞如C3H10T1/2、MC3T3-E1和RPC-C2A中过表达DMP-1能够诱导这些细胞分化和形成成牙本质细胞样细胞，同时DMP-1可促进转基因成纤维细胞矿化结节形成[33-34]。He等[18]推测DMP-1在体外可启动磷灰石晶体形成，且实验证实DMP-1在生理状态下具有钙结合能力。DMP-1能够使羟磷灰石成核，首先是结合钙离子并启动矿物沉积，接着是成核的无定形钙磷沉淀物成熟，晶体形成。同时，Tartaix等[35]研究发现，原核细胞非磷酸化DMP-1可作为羟磷灰石核心促进矿化形成，而磷酸化DMP-1对矿化形成无明显作用。DMP-1在真核细胞中作用比较复杂。研究显示，牛dmp-1全长基因是矿化抑制剂，然而大鼠dmp-1 C末端却是羟磷灰石晶体成核剂。最近，Gajjeraman等[36]研究表明，大鼠重组dmp-1全基因及天然dmp-1 C末端在Ⅰ型胶原作用下均可加速羟磷灰石的成核作用，而dmp-1 N末端则抑制成核。

    DMP-1氨基酸序列中有一个RGD序列，实验证实RGD序列与细胞黏附有关[17]，含有RGD序列的DMP-1可迅速与RPC-C2A和MC3T3-E1结合，大大促进其与细胞间的黏附。这提示DMP-1可介导细胞间或细胞与非胶原基质间的信号转导。这一推断被以后的研究进一步证实。Naraya-nan等[33]用外源性DMP-1为启动因子作用于暴露的牙髓断面上，促进牙髓的分化及未分化的外胚间充质细胞向成牙本质细胞分化。总之，体外试验均证实DMP-1可通过调控因子诱导细胞分化并同时作为羟磷灰石晶体核心促进矿化形成。

    3．2  牙本质基质蛋白-1在骨组织形成中的作用

    DMP-1高表达于胚胎发育过程中的成骨细胞，如上所述DMP-1在诱导细胞分化及促进矿化过程中起到重要作用。据推测dmp-1敲除的小鼠应表现为骨矿化减少，但实验证实dmp-1缺失的新生小鼠无严重异常，这表明在骨形成早期还有其他基因补偿修复DMP-1的矿化功能[1]。dmp-1敲除小狗出生后逐渐表现出典型的佝偻病和骨软化症，症状在出生后第1周开始出现，以后随年龄增长逐渐加重[37-41]。另有实验证实： DMP-1在骨细胞的表达远远高于在其他矿化组织中的表达，尤其在骨细胞树状突起中表达更加明显[40]。

    定量研究发现，机械负载可使骨细胞中DMP-1表达增加2～3.7倍；定性研究表明，骨细胞DMP-1的表达水平与骨细胞承受的机械负荷相适应[42-44]。这些结果说明骨细胞分泌的DMP-1蛋白与新骨形成，动态骨改建及机械应力传导都密切相关。

    3．3  牙本质基质蛋白-1在牙本质形成中的作用

    DMP-1在牙髓和成牙本质细胞中均有表达，DMP-1缺失可导致牙体组织矿化缺陷[45-46]，表现为前期牙本质向成熟牙本质发育障碍，髓腔增大，前期牙本质区增宽以及牙本质小管异常。另外dmp-1缺失小鼠与牙本质涎磷蛋白（dentin sialo-phosphoprotein，DSPP）缺失小鼠表现相似[47]，提示二者参与了相同的信号通路。

    有研究显示，DMP-1是dspp基因的反应元素[37]。体内试验表明，在dmp-1缺失的小鼠中出现了DSPP表达的明显下降[41]。DMP-1表达受启动因子CollaI的调控，CollaI在整个牙齿发育过程中均有活性，并且对矿化缺陷和牙本质小管及第三磨牙发育缺陷有修复作用。敲除dmp-1小鼠中成牙本质细胞骨钙蛋白的表达显著下降，通过dmp-1转基因可完全修复骨钙素的表达缺失。由此推测DMP-1是成牙本质细胞分化，牙本质小管形成和矿化的关键因素，并且DMP-1在成牙本质细胞形成的早期和后期以及牙本质的形成过程均有重要作用[48]。

    4  展望

    随着对DMP-1研究的不断深入，DMP-1的基因表达、生物化学特性、细胞分布和功能已逐渐被认识。总结如下：1）机械负载和磷的水平对DMP-1的表达起重要调控作用；2）在dmp-1全基因序列中相对分子质量为5.7×104的C末端是主要的功能片断；3）DMP-1 对矿化过程的启动及矿化增殖均有重要作用；4）DMP-1对成牙本质细胞和成骨细胞的成熟具有调节作用。5）神经细胞黏附分子蛋白是功能性成牙本质细胞的新标志性蛋白[48-49]，对研究DMP-1在牙齿发育及病理学过程中的作用重要。总之，无论是动物实验还是常染色体隐性遗传性佝偻患者的dmp-1基因突变的鉴定都证明DMP-1在调节矿化和磷平衡中起重要作用。另外，在今后的研究中还有如下一些问题需要解决，如DMP-1在正常生理条件下如何调节磷平衡，DMP-1如何在细胞内发挥作用等。 

【参考文献】  [1] Feng JQ, Huang H, Lu Y, et al. J Dent Res, 2003, 82（10）：776-780.

[2] Terasawa M, Shimokawa R, Terashima T, et al. J Bone Miner Metab, 2004, 22（5）：430-438.

[3] George A, Sabsay B, Simonian PA, et al. J Biol Chem, 1993, 268（17）：12624-12630.

[4] Thotakura SR, Karthikeyan N, Smith T, et al. J Biol Chem, 2000, 275（14）：10272-10277.

[5] MacDougall M, Gu TT, Luan X, et al. J Bone Miner Res, 1998, 13（3）：422-431.

[6] Hirst KL, Ibaraki-O′Connor K, Young MF, et al. J Dent Res, 1997, 76（3）：754-760.

[7] Toyosawa S, Sato A, O′hUigin C, et al. J Mol Evol,2000, 50（1）：31-38.

[8] Toyosawa S, O′hUigin C, Tichy H, et al. Gene, 1999, 234（2）：307-314.

[9] Van Den Bussche RA, Reeder SA, Hansen EW, et al. Mol Phylogenet Evol, 2003, 26（1）：89-101.

[10] Kim JW, Yamakoshi Y, Iwata T, et al. Eur J Oral Sci,2006, 114（1）：33-41.

[11] Lu Y, Zhang S, Xie Y, et al. Cells Tissues Organs, 2005, 181（3/4）：241-247.

[12] Lu Y, Xie Y, Zhang S, et al. J Dent Res, 2007, 86（4）：320-325.

[13] Franceschi RT. Crit Rev Oral Biol Med, 1999, 10（40/57）：40-57.

[14] Karsenty G, Ducy P, Starbuck M, et al. Bone, 1999, 25（1）：107-108.

[15] Narayanan K, Ramachandran A, Hao J, et al. Connect Tissue Res, 2002, 43（2/3）：365-371.

[16] Chen S, Inozentseva-Clayton N, Dong J, et al. J Cell Biochem, 2004, 92（2）：332-349.

[17] Kulkarni GV, Chen B, Malone JP, et al. Arch Oral Biol, 2000, 45（6）：475-484.

[18] He G, Dahl T, Veis A, et al. Nat Mater, 2003, 2（8）：552-558.

[19] Butler WT, Brunn JC, Qin C, et al. Connect Tissue Res, 2002, 43（2/3）：301-307.

[20] Fen JQ, Zhang J, Dallas SL, et al. J Bone Miner Res, 2002, 17（10）：1822-1831.

[21] Qin C, Brunn JC, Cook RG, et al. J Biol Chem, 2003, 278（36）：34700-34708.

[22] Fisher LW, Jain A, Tayback M, et al. Clin Cancer Res,2004, 10（24）：8501-8511.

[23] Ogbureke KU, Fisher LW. Kidney Int, 2005, 68（1）：155-166.

[24] Ogbureke KU, Fisher LW． J Histochem Cytochem, 2007,55（4）：403-409.

[25] Ogbureke KU, Nikitakis NG, Warburton G, et al. Oral Oncol, 2007, 43（9）：920-932.

[26] Baba O, Qin C, Brunn JC, et al. Eur J Oral Sci, 2004, 112（2）：163-170.

[27] Septier D, Torres-Quintana MA, Menashi S, et al. Eur J Oral Sci, 2001, 109（3）：198-203.

[28] Toyosawa S, Shintani S, Fujiwara T, et al. J Bone Miner Res, 2001, 16（11）：2017-2026.

[29] Ogbureke KU, Fisher LW. J Dent Res, 2004, 83（9）：664-670.

[30] Chaplet M, De Leval L, Waltregny D, et al. J Bone Miner Res, 2003, 18：1506-1512.

[31] Toyosawa S, Tomita Y, Kishino M, et al. Mod Pathol,2004, 17（5）：573-578.

[32] Karadag A, Fedarko NS, Fisher LW. Cancer Res, 2005, 65（24）：11545-11552.

[33] Narayanan K, Srinivas R, Ramachandran A, et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001, 98（8）：4516-4521.

[34] 刘冬梅, 董福生, 王 洁, 等. 中华口腔医学杂志, 2007, 42（6）：373-377.

[35] Tartaix PH, Doulaverakis M, George A, et al. J Biol Chem, 2004, 279（18）：18115-18120.

[36] Gajjeraman S, Narayanan K, Hao J, et al. J Biol Chem,2007, 282（2）：1193-1204.

[37] Nakasone N, Yoshie H, Ohshima H. Arch Oral Biol, 2006, 51（5）：378-386.

[38] Ling Y, Rios HF, Myers ER, et al. J Bone Miner Res, 2005, 20（12）：2169-2177.

[39] Ye L, Mishina Y, Chen D, et al. J Biol Chem, 2005, 280（7）：6197-6203.

[40] Feng JQ, Ward LM, Liu S, et al. Nat Genet, 2006, 38（11）：1310-1315.

[41] Bonewald LF. Bonekey Osteovision, 2006, 3（10）：7-15.

[42] Gluhak-Heinrich J, Ye L, Bonewald LF, et al. J Bone Miner Res, 2003, 18（5）：807-817.

[43] Yang W, Kalajzic I, Lu Y, et al. J Musculoskelet Neuronal Interact, 2004, 4（4）：386-387.

[44] Yang W, Lu Y, Kalajzic I, et al. J Biol Chem, 2005, 280（21）：20680-20690.

[45] Ye L, MacDougall M, Zhang S, et al. J Biol Chem, 2004, 279（18）：19141-19148.

[46] Lu Y, Ye L, Yu S, et al. Dev Biol, 2007, 303（1）：191-201.

[47] Sreenath T, Thyagarajan T, Hall B, et al. J Biol Chem, 2003, 278（27）：24874-24880,

[48] Ka S, Oka K, Xu X, et al. Mech Dev, 2007, 124（6）：409-415.

[49] Akasone N, Yoshie H, Ohshima H. Arch Oral Biol, 2006, 51（5）：378-386.