人类疱疹病毒6型与口腔恶性肿瘤相关性的研究

作者：杨婕　朱玲　王芳　姚 　　［摘要］  目的：研究人类疱疹病毒6型(HHV-6)的感染与口腔恶性肿瘤的相关性及其在临床诊疗中的意义。方法：运用巢式PCR技术，对40例口腔恶性肿瘤患者的血液、唾液、癌组织、正常组织及40例正常对照人群血液、唾液中人类疱疹病毒6型DNA进行检测分析。结果：恶性肿瘤组和对照组唾液中HHV-6 DNA阳性率分别为85.0%、45.0%，其差别具有统计学意义（P＜0.01）;两组血液中HHV-6检出阳性率分别为67.5%、22.5%，其差别亦具有统计学意义（P＜0.01）。两组唾液中的阳性检出率均大于血液。癌组织阳性检出率（78.95%）显著大于正常组织（10.53%），具有统计学意义（P＜0.01）。结论：进一步证实了唾液腺是HHV-6长期潜伏和增殖的部位，唾液是其主要的传播媒介，为临床简便有效诊断提供参考。HHV-6感染与口腔恶性肿瘤之间存在相关性，可能参与肿瘤发生、细胞癌变的过程。　　［关键词］  人类疱疹病毒6型  口腔恶性肿瘤  巢式聚合酶链反应　　The Correlation between Human Herpesvirus-6 (HHV-6) and Oral Malignancy. YANG Jie, ZHU Ling, WANG Fang, et al. Nanjing Medical University Stomatological College, Nanjing 210029　　［Abstract］Objective: To investigate the clinical significance of human herpesvirus-6's（HHV-6）infection and its correlation to oral malignancy. Methods: Samples of saliva, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), cancer tissue and normal tissue collected from 40 patients with oral malignancy and 40 healthy young adults were tested for human herpesvirus-6 by nested PCR assays. Results: HHV-6 DNA positive rates were 85.0% and 45.0% in the salivas of patients and control group respectively, 67.5% and 22.5% in the PBMCs of patients and control group respectively, both of which demonstrated statistical difference. In both groups HHV-6 DNA positive rates in saliva were higher than those in PBMCs. The positive rate in cancer tissues(78.95%) was significantly higher than that of normal tissues(10.53%). Conclusion: The result confirms that saliva gland is the latenty and proliferation position of HHV-6 and saliva is the predominant transmission route of HHV-6. The infection of HHV-6 correlates to oral malignancy, which suggests HHV-6 may play a role in the occurrence and cell transformation of malignancy.　　［Key words］  HHV-6  Oral  Malignancy  Nested polymerase chain reaction　　人类疱疹病毒6型(HHV-6)是近年来新分离出的对T淋巴细胞具有高度亲嗜性的DNA病毒,分为A、B两型，代表株分别分GS、U1102株和Z29株。在健康成人和患玫瑰疹的儿童唾液及外周血单核细胞中均可分离到。与人类的多种疾病有关，其感染与多种肿瘤的关系正在研究中，HHV-6具有致癌潜能的证据首先来自于将HHV-6完整基因组或基因片断转染NIH3T3细胞引发裸鼠肿瘤［1］，及人上皮角质细胞癌变［2］；其次为HHV-6的ORF-1蛋白能与野生型抑癌基因p53特异性DNA区域相结合，抑制p53基因的正常转录，阻止了p53基因在细胞生长过程中的调节能力［3］，使大量的细胞基因和蛋白发生了转化或者紊乱；第三为HHV-6可在多种肿瘤组织中检测出,包括淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病［4］、宫颈癌［5］、鼻咽癌［6］及其相关癌前病变。口腔肿瘤患者体内的HHV-6抗体滴度非常高［7］或新鲜肿瘤组织中HHV-6 DNA的检出率高于正常人群［8］。但目前尚未见HHV-6感染与口腔恶性肿瘤相关性的明确报道。　　本文运用巢式PCR技术，首次对口腔恶性肿瘤和正常人群的外周血单个核细胞、唾液、组织3种样本中的HHV-6 DNA进行全面检测，比较两两间差异, 为探讨HHV-6与肿瘤发生、细胞转染之间的关系提供依据，为临床简便有效诊断和治疗HHV-6感染提供参考。　　1  材料与方法　　1.1  标本来源  口腔恶性肿瘤组为前来江苏省口腔医院颌面外科初次就诊或复发的40例口腔恶性肿瘤患者,在治疗初期收集外周血液,唾液,癌组织,正常组织。其中25为男性,15例为女性，其中30~40岁4例，41~50岁11例，51~60岁8例，61~70岁11例，大于70岁6例，平均年龄为55.8岁。包括鳞癌、腺癌、上颌窦癌、恶性淋巴瘤，疾病性质由病理切片确诊。正常健康人群对照组为在校大学生40名，收集外周血液、唾液样本.男性20例,女性20例.年龄为21~24岁，平均年龄22.2岁。所有血样样本经我院检验科确认乙肝表面抗原、丙肝病毒抗体、艾滋病抗体、梅毒检测均为阴性，转氨酶在正常范围内。所有患者与健康受试者均签署试验知情同意书。　　1.2  试剂　　1.2.1  PCR引物序列  根据参考文献［9］设计巢式PCR扩增HHV-6 DNA的内外侧2对引物，由上海生工生物工程有限公司合成，最终扩增产物分子量为163bp。外引物：P1 5’-AGTCATCACGATCGGCGTGTATC-3’；P2 5’-TATCTAGCGCAATCGCTATGTCG-3’。内引物：P3 5’-TCGACTCTCACCCTACTGAACGAG-3’；P4 5’-TGACTAGAGAGCGACAAATTGGAG-3’。　　1.2.2  PCR反应系统  包括Buffer、MgCl2、dNTP、Taq酶，由日本TaKaRa公司提供。蛋白酶K由生工公司合成。DNA Marker Ⅰ由北京天为时代科技有限公司合成。琼脂糖为Spanish分装。酚、氯仿、异戊醇由中国医学科学院生物医学工程研究所提供。　　1.3  方法　　1.3.1  标本的处理  采集新鲜抗凝血1.8 mL反复洗涤至白细胞沉淀基本无色,将沉淀重悬于0.8 mL抽提缓冲液中，混匀加蛋白酶K 8 μL，52 ℃消化2 h；吸取0.8 mL唾液标本，加蛋白酶K 8 μL混匀置于55 ℃水浴中消化3 h或37 ℃过夜；病理科切取经10%甲醛固定的癌组织和正常组织各0.1 g，分别加1.2 mL抽提缓冲液研磨成匀浆状，经铜网过滤取上清液,加入蛋白酶K 55 ℃过夜消化. Tris饱和酚、氯仿、异戊醇抽提取上清液,无水乙醇-20 ℃过夜沉淀DNA，干燥后加20 μLTE缓冲液溶解，4 ℃保存备用。　　1.3.2  PCR反应体系为25 μL, 各反应内容含量见表1。HHV-6 内外PCR循环条件均为：94 ℃预变性5 min，→94 ℃ 35 s，51 ℃ 45 s，72 ℃ 55 s，扩增35个循环→72 ℃延伸5 min。4 ℃保存。同时设立阳性、阴性及空白对照，阳性对照为U1102株，阴性对照为HHV-6阴性的J-Jhan细胞系，两者均由南京医科大学微生物与免疫实验室惠赠，空白对照取模板为水。将扩增产物于1.5％琼脂糖凝胶上电泳，紫外透射仪下观察结果并用凝胶成像系统拍照分析，与PCR分子量标记物比较，标本若在163 bp处出现特异性扩增条带则视为HHV-6阳性。　　2  结果　　2.1  DNA质量 按照以上设计的方法将DNA模板于紫外分光光度仪上测DNA和混杂蛋白质的量,血液及唾液样本稀释至100 μL,组织样本稀释至200 μL。结果均数见表2。DNA与蛋白质含量之比在1.8左右，提示本实验DNA抽提质量良好。　　2.2  HHV-6 DNA PCR扩增产物为163 bp，与预期产物分子量相同，电泳图见图1。扩增产物经DNA测序，证实为HHV-6的目的基因。图1  略　　2.3  正常人群对照组与肿瘤病人各40例,血液、唾液HHV-6 DNA检出阳性率的比较结果见表3。38例恶性肿瘤病人癌组织与正常组织中HHV-6 DNA阳性检验率的结果见表4。　　2.4  统计学分析  表3采用两样本率比较的u检验。肿瘤病人唾液中HHV-6阳性率(85.0%)高于正常对照组(45.0%)，其差别具有统计学意义（u=3.52，P=0.0002＜0.01）；肿瘤病人血液中HHV-6阳性率67.5%显著高于正常人群血液中的22.5%，其差别亦具有统计学意义（u=3.826，P=0.0001＜0.01）。 正常人群对照组唾液中HHV-6检出率大于血液中检出率（u=1.89，单侧P=0.03＜0.05），而在肿瘤患者中唾液与血液中HHV-6 DNA的检出率尚无统计学上的差别（u=1.58，单侧P=0.06＞0.05）。　　表1  巢式PCR反应体系　略　　表4采用四格表fisher确切概率法分析数据 ，癌组织中HHV-6 DNA的检出率78.95%显著大于癌旁正常组织10.53% （P=0.00001＜0.01）　　表2  各样本模板中DNA与蛋白质含量之比　略　　表3  肿瘤病人组与正常人群组血液、唾液HHV-6 DNA检出情况　略　　表4  癌组织与正常组织中HHV-6 DNA阳性检出情况　略　　3  讨论　　HHV-6属于有包膜的β疱疹科病毒，病毒广泛存在于人外周血淋巴细胞,唾液腺分泌液、活体组织等多种细胞和组织中,最主要感染的细胞是CD4+T淋巴细胞，受病毒感染的细胞可出现空泡样变、肿胀、多核细胞形成，最终可导致CD4+T细胞的凋亡。　　目前国内外对HHV-6感染的诊断主要依据病毒学、血清学和分子生物学的检测。本实验采用巢式聚合酶链反应技术检测HHV-6 DNA，敏感性高、方法简便、获得结果迅速, 保证病毒含量低时仍能检测出，可为临床快速诊断和流行病学调查提供依据。PCR 技术不仅可检出急性期和恢复期病人外周血单核细胞中的病毒DNA ,还可检出淋巴瘤组织中整合在宿主细胞DNA中的病毒基因,为研究HHV-6 的持续、潜伏感染及其与肿瘤的关系提供了良好的手段。　　虽然HHV-6最早是在外周血单核细胞中分离出来的，唾液中很难分离出具有感染性的病毒，但现在普遍认为唾液在其传播中扮演着重要的角色。本实验结果与国内外相关报道近似，在正常健康人群唾液中HHV-6 DNA的检出率高于外周血液，进一步证实了唾液腺是其长期潜伏和增殖的部位，HHV-6可随唾液排出体外，带毒唾液是引起HHV-6在人群中高感染率的重要原因。而恶性肿瘤病人唾液、血液中HHV-6 DNA的阳性率无明显差异，提示在肿瘤病人血液中HHV-6有所增殖，这可能与患者的免疫能力下降后才引发HHV-6的激活或再感染有关。  　　根据实验数据比较可看出，对于同一个体来说唾液中更易检测出HHV-6 DNA，反映为样本中唾液中阳性检出率大于外周血液，这一结果提示对于HHV-6 DNA的检测可从唾液中取材，有利于临床快速有效、无痛、无感染的诊断HHV-6感染。　　本实验检测口腔恶性肿瘤患者HHV-6 DNA阳性率显著高于正常人群，提示该病毒的感染与口腔恶性肿瘤之间存在相关性，对于恶性肿瘤的早期治疗可辅以干扰素。因据文献报道［10］成年后HHV-6感染率的变化与年龄增长无显著相关性，故分析时未考虑年龄因素的干扰。　　病毒的激活是病毒进入细胞的先决条件，结合HHV-6在癌组织中的检出率显著高于正常组织这一实验结果推测：HHV-6在癌变早期即发生激活/再感染从而进入癌细胞中增殖。这提示HHV-6可能直接参与细胞癌变的过程，即是细胞转化的促进因子之一。　　本试验以巢式PCR法检测HHV-6 DNA的阳性率，但未能将潜伏性感染与活动性感染相区分，如辅以逆转录PCR法，即可检测出HHV-6活动性感染的情况，有利于进一步分析HHV-6与肿瘤激发的相关性，这方面有待进一步研究。　　参考文献　　［1］  Razzaque A. Oncogenic potential of human herpesvirus-6 DNA ［J］. Oncogene, 1990, 5(9)∶1 365-1 370　　［2］  Razzaque A,Williams O,Wang J, et al. Neoplastic transformation of immortalized human epidermal keratinocytes by two HHV-6 DNA clones ［J］. Virology,1993, 195(1)∶113-120　　［3］  Kashanchi F, Araujo J, Doniger J, et al. Human herpesvirus type 6 (HHV-6) ORF-1 transactivating gene exhibits malignant transforming activity and its protein binds to p53 ［J］. Oncogene,1997,14(3)∶359-367　　［4］  刘军连,徐志凯,张永清，等.人疱疹病毒6型感染与白血病关系的初步研究［J］.细胞与分子免疫学杂志,2003,19(6)∶618-619　　［5］  Tran-Thanh D, Koushik A, Provencher D, et al. Detection of human herpes virus type 6 DNA in precancerous lesions of the uterine cervix ［J］. J Med Viroy, 2002，68(4)∶606-610　　［6］  简少文,宋立兵,陈心春,等.HHV-6感染在鼻咽癌发病中的意义［J］.中国肿瘤临床,2003,30(2)∶109-111　　［7］  Shanavas KR, Kala V, Vasudevan DM. Anti-HHV-6 antibodies in normal population and in cancer patients in India ［J］. Journal of Experimental Pathology, 1992, 6(1-2)∶95-105　　［8］  Yaday M, Chandrashekran A, Vasudevan D M ,et al. Frequent detection of human herpesvirus 6 in oral carcinoma ［J］. J Natl Cancer Inst, 1994, 86(23)∶1 792-1 794　　［9］  于琦，吴玉清，赵林.青岛地区献血者人疱疹病毒6型感染的调查［J］.中国输血杂志,2005,18(1)∶54-56　　［10］  Mary T, Michael P, Stephen Dewhurst，et al. Human Herpesvirus 6 (HHV-6) DNA Persistence and Reactivation in Healthy Children ［J］. J Pediatr, 2004, 145∶478-484