机械牵张后大鼠颅缝成骨样细胞Ets1和Cbfa1基因表达的研究

机械牵张后大鼠颅缝成骨样细胞Ets1和Cbfa1基因表达的研究作者：邹淑娟　戚孟春　胡静　陈扬熙　罗颂椒 　［摘要］  目的：探讨大鼠颅骨缝成骨细胞在张应力作用下Ets1和Cbfa1基因表达的变化，以揭示骨缝牵张成骨的分子机制。方法：分离培养新生大鼠颅缝成骨样细胞，应用四点弯曲细胞加力装置对其施加单一周期的机械张力，并通过SYBR Green实时定量RT-PCR技术，对Ets1和Cbfa1的基因表达进行检测。结果：Ets1和Cbfa1的mRNA水平分别在机械张应力作用后6 h及12 h内显著增高，随后，mRNA水平逐渐恢复到对照组水平，Ets1先于Cbfa1表达，在加力后表达立即升高，并在0.5h达到最高水平，而Cbfa1则首先经历一个短暂的潜伏期，后表达逐渐升高，在6 h达到最高水平，Cbfa1的最高表达水平约为Ets1的2.58倍。结论：Ets1和Cbfa1在骨缝牵张中对成骨细胞合成分泌骨基质蛋白可能起着不同的调节作用，而它们的功能具有时序性。高频率的牵张 (>2次/24 h)更有利于Ets1和Cbfa1的最佳表达。　［关键词］  骨缝牵张  成骨细胞  Ets1  Cbfa1  实时定量RT-PCR　　Expression Patterns of Ets1 and Cbfa1 in Rat Calvarial Sutural Osteoblast-like Cells after a Single Period of Mechanical Strain. ZOU Shu-juan, QI Meng-chun, HU Jing, et al. West China School of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041　［Abstract］Objective: Effects of a single period of mechanical strain on gene expression patterns of two osteogenic transcription factors, Ets1 and Cbfa1, in rat calvarial sutural osteoblast-like cells were studied in this study to elucidate the molecular mechanism of suture distraction. Methods: The cells were isolated and cultured in vitro, and subjected to a single 40 minutes mechanical strain using a four-point bending apparatus. The gene expression patterns of Ets1and Cbfa1 were examined by SYBR Green real-time RT-PCR. Results: Both mRNA levels of Ets1 and Cbfa1 increased significantly within 6 and 12 hours respectively after mechanical strain, and the increase returned to control level thereafter. However, Ets1and Cbfa1 exhibited different temporal expression patterns: Ets1 expressed immediately after the mechanical loading and reached the maximum transcription at 0.5h; whereas Cbfa1 experienced a latency period first, then increased slowly within 2 hours, and reached the maximum transcription at 6h. The maximum transcription of Cbfa1 was about 2.58 fold of that of Ets1. Conclusion: Ets1and Cbfa1 may play different roles in regulating bone matrix protein expressions in osteoblast-like cells during suture distraction and their function is time-dependent. High frequency distraction (>2times/24h) is favorable to the maximal expression of two genes. 　［Key words］  Suture distraction  Osteoblasts  Ets1  Cbfa1  Real-time RT-PCR    骨缝（suture）是颅面骨发育的一个重要生长区域，其组织对机械力刺激极为敏感。近年来，缝牵张(suture distraction)作为颅面牵张成骨（distraction osteogenesis,DO）的一个重要内容，逐步受到学者们的重视，该方法有望成为矫治牙弓狭窄、面中份发育不足以及颅骨早闭（craniosynostosis）等颅颌面畸形的有效手段［1］。在缝牵张中，机械力刺激下骨基质蛋白基因在成骨细胞中的高表达是骨缝牵张新骨形成的基础，而这些基因的表达涉及复杂的信号分子网络，其中转录因子Cbfa1和Ets1可能在其中发挥重要的调控作用。本研究应用四点弯曲细胞加力装置，通过SYBR Green实时定量RT-PCR，对大鼠颅缝成骨样细胞在单一周期的机械张力刺激后Cbfa1和Ets1的基因表达规律进行研究，为探索颅面骨缝牵张成骨的分子机制提供实验依据。1  材料与方法　　1.1  细胞分离、培养及矿化  用出生3 d SD大鼠，　　图1  略　　无菌条件下解剖出颅骨，去净骨膜及软组织，切取颅骨矢状缝及冠状缝处1 mm宽组织，剪成<0.5 mm的组织块，均匀铺散在培养瓶底壁上。将培养瓶底面朝上，小心加入5 mL含10%（v/v）胎牛血清（FBS）的DMEM培养基（Gibico）。37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下培养4 h，小心翻转培养瓶，继续培养。5~7 d后更换培养基，去除组织碎片，细胞长满培养瓶时消化传代。取第3代细胞，按5×104的细胞密度制备细胞爬片，并于贴壁后48 h进行矿化诱导。矿化诱导液为内含10%（v/v）FBS、10 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、0.05 mmol/L抗坏血酸( Sigma，USA) 的DMEM。每4 d换液一次，共诱导2周，并进行碱性磷酸酶(AKP)、矿化结节茜素红染色。　　1.2  细胞加力  细胞加力采用华西口腔医院正畸科和电子科技大学联合研制的四点弯曲加力系统进行。加力参数为位移1 mm，频率0.5 Hz，此时细胞所受机械张应力为2 000 μg。取第3代细胞并使之同步化，转移到特制塑料加力板上，继续培养48 h后在特制的加力培养皿内加力。为了排除加力过程中流体剪切力对细胞的影响，同时在加力培养皿底部置一枚接种细胞的塑料板作为实验对照。加力时间为40 min，并于加力后0、0.5、1、2、6、12、24 h收获细胞，每一基因每一时间点共进行3次独立的实验。　　1.3  Cbfa1和Ets1基因表达检测  机械牵张后提取细胞总RNA，并用RevertAidTM试剂盒(Femerltas, Lithuania)按说明逆转录成cDNA。PCR采用荧光染料SYBR Green I在实时定量PCR仪（ABI Prism 7700，USA）上进行，Cbfa1和Ets1引物序列见表1。以GAPDH为内对照，PCR反应条件为：94 ℃ 2  min， 53 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，共45个循环。用GAPDH的cDNA经倍比稀释后进行同期PCR，用于回归分析。反应结束后在PCR仪上自动读取阈值Ct；PCR产物同时进行琼脂糖凝胶电泳分析。　　1.4  统计学处理  用SPSS 10.0软件对每一时间点的牵张细胞和实验对照细胞进行配对t检验，P≤0.05差异具有显著性。2  结果　　2.1  细胞培养及矿化  大鼠颅缝成骨样细胞原代培养第3天，可见有梭形细胞从组织块中游出，均匀分布在组织块周围。从第5天起，细胞增殖速度加快，一般10~14 d细胞可达80%~90%融合，见图1a，此时细胞以梭形和多角形为主。第3代细胞经矿化诱导后，多数细胞表现为AKP染色强阳性，并有明显的矿化结节形成，茜素红染色表现为鲜红色，见图1b，c。说明本试验所获细胞为成骨样细胞，在体外具有矿化细胞外基质的能力。　　2.2  Cbfa1和Ets1基因表达  大鼠颅缝成骨样细胞经机械张力作用后，凝胶电泳显示PCR产物为单一条带，见图2，说明在各时间点均有Cbfa1和Ets1的特异表达。　　图2  略    实时定量RT-PCR检测表明，张应力作用下，Cbfa1和Ets1的表达在一定时间内（6~12 h）与对照组细胞比较均显著增高（P<0.05或P<0.01）。而其表达规律和表达水平有明显差异，见图3，Ets1在加力后表达立即升高，0.5 h达到最高水平，随后缓慢下降，6 h后恢复到对照组细胞表达水平，而Cbfa1则首先经历一个短暂的潜伏期，后从0.5 h开始逐渐升高，在6 h达到最高水平，12 h后恢复到对照组水平。Cbfa1的最高表达约为Ets1的2.58倍。　　图3  略3  讨论    缝牵张作为一项新的组织工程技术，目前国际学术界已将其归类于牵张成骨（DO）［2］，并成为矫治牙弓狭窄、面中份发育不足以及颅骨早闭等颅颌面畸形的有效手段。然而，缝牵张又具有不同于传统DO的特点，它不需要进行骨切开或骨皮质切开，而是在天然骨缝隙内，利用骨缝组织对机械应力的高反应性进行牵引或扩张，达到分离骨缝并继发成骨的目的。正是由于骨缝组织自身的特性，研究颅面骨缝组织在牵张力作用下的改建规律以及骨缝成骨细胞生物力学的反应机制，己经成为颅颌面矫形治疗领域中一个新的课题。    Cbfa1和Ets1是两个重要的转录调节因子，他们通过与许多骨基质蛋白（Osteocalcin、Osteopontin、Osteonectin、AKP、Type I collagen）基因DNA上特殊的调节区相结合，来激活并调节这些基因的转录［3］。研究表明，这两种因子对骨组织的发育和成骨细胞的分化和成熟起重要的的调控作用。Cbfa1基因突变将导致小鼠的骨发育障碍［4］及人类的颅锁骨发育不全［5］，在成骨细胞的分化、成熟过程中，Ets1主要在其最初的增殖期发挥作用，而Cbfa1则主要作用在随后的分化和成熟阶段［3，6］。同时，研究表明骨基质蛋白osteopontin上同时具有Cbfa1和Ets1的结合位点，Cbfa1和Ets1可通过相互作用来共同调解该基因的表达［7］。骨缝牵张实际上是一个在机械张应力作用下，骨缝扩大，骨缝成骨细胞分泌各种生长因子及骨基质蛋白，并进一步矿化形成新生骨组织的过程，因而Cbfa1和Ets1在其中必然发挥着重要的调控作用。研究张应力作用下成骨细胞中Cbfa1和Ets1的表达规律，将有助于对骨缝牵张新骨形成分子机制的认识。    本研究结果显示，大鼠颅缝成骨样细胞在单一周期的机械张力刺激后，在一定时间内（6~12 h）Cbfa1和Ets1均表现为表达上调，但二者存在不同的表达规律。Ets1先于Cbfa1表达，在加力后表达立即升高，并在0.5 h达到最高水平，而Cbfa1则首先经历一个短暂的潜伏期，后表达逐渐升高，在6 h达到最高水平，Cbfa1的最高表达约为Ets1的2.58倍。上述结果表明，Ets1和Cbfa1对张应力作用下成骨细胞中骨基质蛋白基因的表达可能起着不同的调控作用，这种调控作用具有时序性。    牵张频率是决定牵张成骨新骨形成的重要因素，临床上采用的牵张频率多为1~4次/d［8］；研究显示较高的频率更有利于牵张骨痂形成。这虽然可归因于较高频率下机械力刺激更符合生理水平，对新生血管和软组织损伤更小，但其深入的分子机制目前尚不清楚。本研究用单一周期的张应力刺激来模拟临床上牵张成骨的单次加力，结果表明Ets1和Cbfa1表达在加力后6~12 h显著升高，随后逐步恢复到对照组水平。上述结果提示在一天内如果仅施加一次机械力刺激，细胞将经历较长的无反应期（约为12~18 h），而要获得最佳的基因表达，一天施加≥2次的机械刺激将是合理的。此时，基因表达上调的效应可叠加在一起。本试验的加力模式并不能完全模拟体内缝牵张的单次加力，但实验结果在一定程度上仍然反映了体内单次牵张后成骨细胞基因表达的规律，在分子水平上为较高频率牵张更有利于骨痂形成提供了一个合理的解释。    本研究表明，单一周期的机械张力刺激后，Ets1和Cbfa1在大鼠颅缝成骨样细胞中的表达具有不同的时间规律和表达水平，说明该两种转录因子对成骨细胞骨基质蛋白基因的表达可能起着不同的调控作用，而这种调控具有时序性，较高频率的机械刺激更有利于Ets1和Cbfa1的最佳表达。参考文献　　［1］  Cho BC, Hwang SK，Uhm KI. 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